第一部分脊索瘤组织与胎儿髓核组织差异表达miRNAs的筛选研究目的筛选人脊索瘤组织和胎儿髓核组织之间差异表达的miRNAs。方法收集脊索瘤组织28例和胎儿髓核组织(12-28周)10例,随机选取其中3例脊索瘤组织和3例胎儿髓核组织,采用Agilent Human miRNA芯片技术检测脊索瘤与胎儿髓核组织之间差异表达的miRNAs,筛选标准为Fold change>2.0且P<0.05。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对芯片检测结果进行验证。结果脊索瘤组织与胎儿髓核组织中miRNAs表达谱存在明显差异。芯片结果发现脊索瘤组织与胎儿髓核组织之间有42个miRNAs显著差异表达(P<0.001),其中19个 miRNAs 上调,分别为 miR-150、miR-497、miR-21、miR-29b、miR-223、miR-143、miR-222、miR-221、miR-4261、miR-374b、miR-185、miR-93、miR-770、miR-1260a、miR-4485、miR-1233-1、miR-365a、miR-211、miR-193a;23 个 miRNAs 下调,分别为 miR-5196、miR-4433、miR-4754、miR-4707、miR-3156、miR-3652、miR-1290、miR-3137、miR-623、miR-3917、miR-4656、miR-4710、miR-33b、miR-4685、miR-4690、miR-9、miR-1471、miR-1273f、miR-1229、miR-1246、miR-6127、miR-320e、miR-320d。qRT-PCR 验证结果显示脊索瘤组织中miR-21,miR-150上调(P<0.05),miR-1290和miR-623下调(P<0.05),与芯片结果相吻合。结论miRNA芯片筛选出脊索瘤组织中42个异常表达的miRNAs,这些miRNAs有可能成为脊索瘤的特异性分子生物学标志物。第二部分miR-1290在脊索瘤组织中的表达及其与侵袭、复发的关系目的研究miR-1290在脊索瘤组织中的表达及其与侵袭、复发等临床病理因素的关系,为脊索瘤的预后判断及分子靶向治疗提供参考依据。方法应用qRT-PCR检测28例脊索瘤组织和10例胎儿髓核组织中miR-1290的相对表达量,并且进一步分析miR-1290表达水平与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、局部侵袭等临床病理因素以及预后的关系。结果qRT-PCR结果显示脊索瘤组织中的miR-1290相对表达量明显低于胎儿髓核组织(P<0.05)。miR-1290的表达水平与脊索瘤的局部侵袭、复发相关(P<0.05),而与患者年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤部位等临床因素无明显相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示miR-1290低表达组平均持续无复发生存期(Recurrence Free Survial,RFS)为 46.1±7.20 月,显著短于 miR-1290 高表达组平均 RFS(115.9±14.61月),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论miR-1290在脊索瘤组织中呈低表达,并且与脊索瘤的局部侵袭和复发明显相关。miR-1290有可能成为预测脊索瘤患者预后的生物学指标和分子靶向治疗的新靶点。第三部分miR-1290对脊索瘤细胞增殖、侵袭能力的影响目的研究miR-1290的表达对脊索瘤细胞增殖、侵袭能力的影响。方法通过转染miR-1290 mimic和inhibitor来调控脊索瘤细胞中miR-1290的表达水平,实验根据不同转染分为miR-1290 mimic、mimic NC、miR-1290 inhibitor及inhibitor NC组,采用qRT-PCR方法检测转染效果。采用细胞克隆实验和Transwell侵袭试验检测转染后脊索瘤细胞增殖与细胞侵袭能力的变化。结果qRT-PCR结果显示miR-1290 mimic转染组miR-1290的表达水平显著增高,miR-1290 inhibitor转染组miR-1290的表达水平显著降低。细胞克隆实验显示miR-1290 mimic 转染组细胞集落形成数量显著低于 mimic NC 转染组,而 miR-1290 inhibitor转染组细胞集落形成数量显著高于inhibitor NC转染组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Transwell侵袭试验结果显示miR-1290 inhibitor转染组穿过膜的细胞数量显著高于inhibitor NC转染组,而miR-1290 mimic转染组穿过膜的细胞数量显著低于 mimic NC 转染组(P<0.05)。结论上调miR-1290表达可抑制脊索瘤细胞增殖、侵袭,而下调miR-1290表达可促进脊索瘤细胞增殖、侵袭。第四部分miR-1290靶基因的预测与验证目的预测miR-1290在脊索瘤增殖、侵袭相关的靶基因,并在蛋白水平和基因水平进行验证。方法采用TargetScan、microRNAorg和PITA三个数据库分别对miR-1290进行靶基因预测,对预测结果取交集。采用免疫组化法检测脊索瘤组织中Robol蛋白的表达。采用 Western blot 检测 miR-1290 inhibitor NC 组、miR-1290 inhibitor 组、miR-1290 mimic组、miR-1290 mimic NC组脊索瘤细胞(U-CH1)中Robol蛋白的表达。采用双荧光素酶报告实验鉴定脊索瘤中miR-1290与靶基因Robol 3’UTR的表达调节关系。结果TargetScan,microRNAorg,PITA数据库预测结果的交集共包括762个靶基因,Robol是miR-1290的潜在靶基因。免疫组化结果显示Robol在脊索瘤中的阳性表达率显著高于胎儿髓核组织中的阳性表达率(82.1%vs 20%,P<0.05)。脊索瘤组织中miR-1290的表达量与Robol蛋白表达水平呈显著负相关(P<0.05)。Western blot结果显示miR-1290 inhibitor转染组Robol蛋白表达水平显著增高;miR-1290 mimic转染组Robol蛋白表达水平显著下降(P<0.05)。双荧光素酶报告实验结果显示过表达miR-1290可显著减少Robol-3’UTR的萤火虫荧光素酶活性(P<0.05)。结论Robol是miR-1290在脊索瘤中的一个下游靶基因,miR-1290能负调控Robol基因。第五部分miR-1290调控Robol基因促进脊索瘤细胞增殖、侵袭目的研究miR-1290调控Robol促进脊索瘤细胞增殖、侵袭的作用机制。方法采用siRobol转染脊索瘤细胞U-CH1,Western blot检测siRobol转染后脊索瘤细胞中Robol的蛋白表达,细胞克隆实验和Transwell细胞侵袭实验检测siRobol转染后对脊索瘤细胞增殖和侵袭能力的影响。通过siRobol和miR-1290 inhibitor或miR-1290 mimic共转染U-CH1细胞,细胞克隆实验和Transwell细胞侵袭实验检测共转染后U-CH1细胞增殖、侵袭能力的变化。结果Western blot检测结果提示siRobol转染可显著降低脊索瘤细胞中Robol蛋白的表达,细胞克隆实验和Transwell侵袭实验结果显示下调Robol可抑制U-CH1的细胞增殖、侵袭能力。细胞克隆形成实验结果显示RobolsiRNA + miR-1290 inhibitor共转染组细胞增殖能力显著高于Robol siRNA + inhibitor NC共转染组(P<0.05),而Robol siRNA +miR-1290 mimics共转染组细胞增殖能力显著低于Robol siRNA + mimics NC 共转染组(P<0.05)。Transwell 侵袭实验结果显示Robol siRNA +miR-1290 inhibitor共转染组细胞侵袭能力显著高于Robol siRNA + inhibitor NC共转染组(P<0.05),而RobolsiRNA+miR-1290 mimics共转染组细胞侵袭能力显著低于 Robol siRNA + mimics NC 共转染组(P<0.05)。结论miR-1290可通过调节Robol基因表达促进脊索瘤细胞增殖、侵袭。