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多杀性巴氏杆菌病是畜牧养殖中常见的一种疾病,病菌附着在健康家畜体内,出现应激反应后感染机体,导致出现急性或慢性死亡,造成巨大的经济损失。多杀性巴氏杆菌血清型复杂,养殖户缺乏动物保护意识及科学的检测方法,故本实验根据产毒性巴氏杆菌含有主要毒素蛋白PMT的特性设计快速高效的检测方法。实验一,对全长3858 bp的toxA基因序列进行生物信息学分析,经BLAST方法得出高保守的基因片段(cstoxA),构建重组质粒pMD-19T-cstoxA,测序鉴定,将正确的重组质粒pMD-19T-cstoxA命名为阳性标准品质粒,按照实验室提供的SYBR Green I荧光定量PCR反应体系设计实验,以引物浓度、引物量、模板量、退火温度、反应循环数等方面进行优化,并通过荧光定量PCR反应的Ct值进行曲线计算,绘测出多杀性巴氏杆菌SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线,并分别利用敏感性实验、特异性实验、重复性实验对标准曲线进行鉴定。结果表明:保守性分析得出104 bp的高保守序列,并根据优化的反应体系条件,构建出多杀性巴氏杆菌SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线;在特异性实验中,对不同的8株菌株进行qPCR反应,只有多杀性巴氏杆菌的样品达到了有效反应。在敏感性实验中,对不同梯度的样品进行qPCR反应,发现其灵敏度达到了 102 copies/μL,远高于常规PCR的灵敏度。在重重重复性实中,标准差及变异系数都很低,体现出标准曲线具有很好的重复性。实验二,利用pET-28a原核表达系统对toxA-N、toxA-C进行克隆表达,表达蛋白经Ni-NTA重力柱进行纯化。根据PMT蛋白的空间特性,本实验将全长3858 bp的toxA基因进行分段表达,分别全长为1515 bp的toxA-N基因及全长为2343 bp的toxA-C基因两部分。构建重组质粒pET-28a-toxA-N与pET-28a-toxAC,将其转化至BL21(DE3)感受态细胞中进行表达,最终将表达的toxA-N、toxA-C蛋白依次进行SDS-PAGE、Western blot、蛋白可溶性分析实验,最后将表达的toxA-N、toxA-C蛋白进行Ni-NTA 重力纯化。结果表明:PCR成功扩增出大小为1515 bp、2343 bp的toxA-N、toxA-C基因,以构建的重组质粒进行表达,最终重组质粒pET-28a-toxA-N表达出大小约为60 ku的包涵体蛋白、重组质粒pET-28a-toxA-C表达出大小约为90 ku的包涵体蛋白。将蛋白洗脱液进行分析,得出与toxA-N、toxA-C蛋白大小相同的目的条带,且杂带较少。实验三,利用免疫反应的原理进行多克隆抗体制备及单克隆抗体制备。将制备好的toxA-N、toxA-C蛋白免疫原,分阶段多次皮下免疫新西兰大白兔,45 d后抽取兔血,对血清进行抗体效价检测;取效价较好的蛋白进行后续的单克隆抗体的制备。结果表明:多克隆抗体制备中,toxA-N蛋白作为免疫原的抗体效价达到了 1:6400,toxA-C蛋白作为免疫原的抗体效价为1:3200;toxA-N单克隆抗体与toxA-N多克隆抗体相比,效价是后者的100倍。本实验通过对多杀性巴氏杆菌毒素蛋白(PMT)研究,从基因层次出发,优化PCR反应,建立起羊源多杀性巴氏杆菌SYBR Green I荧光定量PCR诊断方法;从蛋白分子层次出发,运用抗原抗体结合的原理,制备高效的toxA-N多克隆抗体及单克隆抗体,构建出PMT蛋白间接ELISA诊断方法。两种诊断方法的结合,为畜禽疾病诊断提供了新的思路。