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前言:外阴癌是四大妇科恶性肿瘤之一,常见于中老年妇女。外阴鳞状细胞癌（VSCC）是外阴癌最常见的类型,约占外阴恶性肿瘤的90%以上[1,2]。早期患者的5年生存率为80-90%,晚期患者的5年生存率约为15-60%[3]。由于发病率相对较低,一直以来,VSCC发病机制和治疗方面的研究均较其他肿瘤滞后,而且缺乏有效的替代治疗策略。临床上,手术切除是肿瘤的主要治疗方式,联合术后放、化疗对预防肿瘤复发和改善预后方面疗效突出。但是,VSCC对常规化疗不敏感,而且放疗常常伴随着严重的不良反应,限制了术后放化疗的应用,使得VSCC的复发率高达40%。据统计,肿瘤的复发和淋巴结累及,是导致晚期VSCC患者预后不良的两个重要因素;这说明,针对晚期VSCC采用手术联合放、化疗的治疗,效果并不理想[46]。因此,迫切需要寻找新的治疗策略和药物来有效控制VSCC的复发和转移,这具有重大的临床意义。近年来,免疫治疗、中医药治疗和靶向替代治疗的不断发展,大大提高了肿瘤患者的5年生存率。其中,中药正在逐渐成为一种新型的有前景的抗肿瘤替代药物,其临床应用和研究受到越来越多国内外学者的关注[7]。中药的药理作用广泛,在我国有几千年的药用历史,不仅能够用于常见疾病的防治,而且对于肿瘤的治疗也具有良好的疗效。大量研究报道,中药抗肿瘤具有多靶点、多效应、多环节的特点,而且无毒副作用、联合化疗药物能够发挥增效解毒的作用[810]。在中国,有2/3的肿瘤患者接受中药治疗,其疗效已得到国际认可。黄芪是历代中医最常用的一种中药,具有补中益气之功效;几千年来,一直被用来治疗各种疾病,具有丰富的临床药用经验[11,12]。黄芪甲苷（黄芪皂苷IV,AS-IV）是黄芪的特征性单体成分之一,生理活性最强,药用价值高,临床应用前景良好[13,14]。过去几十年的研究发现,AS-IV在多种疾病,包括纤维化、炎症、自身免疫和心血管疾病中疗效突出[1517]。近年来,文献报道,AS-IV在前列腺癌[18]、乳腺癌[19]、胃癌[20]、肺癌[21]、胶质瘤[22]等多种类型肿瘤中发挥了良好的抗癌活性,能够抑制细胞的增殖、侵袭和转移。然而,AS-IV在VSCC中的作用尚未见报道。肿瘤的复发和转移是导致癌症相关死亡的主要原因,转化生长因子β（TGF-β）是一种机体细胞分泌的能够调控细胞各种生物学过程的多功能细胞因子,对细胞的存活、生长、分化以及运动等至关重要;肿瘤发生发展过程中,肿瘤细胞及其周围间质细胞能够大量分泌并激活TGF-β[23,24]。活化的TGF-β通过调控经典TGF-β/Smad信号,以及非Smad信号通路:例如,PI3K/AKT、FAK、ERK和MAPK等信号通路,参与肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和侵袭等生物学过程[25,26]。结合文献报道,外阴癌中TGF-β的蛋白表达增高[27],因此我们的研究旨在探讨AS-IV对外阴鳞状细胞癌细胞的增殖、凋亡、周期及侵袭转移等恶性生物学行为的影响及其与TGF-β信号通路的潜在联系。第一部分:方法:在体外,以外阴鳞癌细胞系SW962细胞为研究对象。通过MTT法检测SW962细胞的活力;平板克隆形成实验评估SW962细胞的长期生长能力;流式细胞仪检测SW962细胞的周期进程和凋亡情况;吖啶橙（AO）染色后通过荧光倒置显微镜观察SW962细胞的形态学变化;应用Western blot技术分析AS-IV给药后细胞增殖、凋亡、周期以及TGF-β/Smad通路中关键蛋白的表达水平。结果:AS-IV（0-800μg/ml）以浓度、时间依赖性的方式抑制SW962细胞的增殖,降低细胞集落形成率,并通过上调细胞周期抑制蛋白P53、P21,下调周期蛋白cyclin D1诱导细胞周期阻滞于G0/G1期;而且AS-IV能够上调促凋亡蛋白Bax、凋亡执行者Cleaved-caspase3的表达,下调抗凋亡蛋白Bcl-2,明显增加SW962细胞的早期和晚期凋亡率;我们还发现,AS-IV给药处理后,SW962细胞中的自噬标记蛋白Beclin-1、LC3 B的表达水平上调,自噬底物蛋白P62表达下调,说明细胞自噬活性被AS-IV增强;当给予3-MA（3-甲基腺嘌呤）抑制自噬活性后,Beclin-1、LC3 B蛋白表达减少,P62表达增加;而且AS-IV促细胞凋亡的作用也被减弱,这表明AS-IV增强外阴鳞癌细胞凋亡的作用与诱导细胞自噬有关。此外,结合前期免疫组化结果,外阴鳞癌组织中存在TGF-βRII和Smad4蛋白表达减少;在我们的研究中发现,AS-IV能够上调SW962细胞中TGF-βRII和Smad4的蛋白表达水平,而且逆转TGF-β1诱导的TGF-βRII和Smad4表达下调的作用;此外,AS-IV通过上调Beclin-1、LC3 B、Cleaved-caspase3,下调Bcl-2,抑制TGF-β1介导的促细胞增殖和抗凋亡的作用。结论:1、AS-IV抑制外阴鳞癌细胞增殖和存活。2、AS-IV外阴鳞癌细胞凋亡与诱导细胞自噬有关。3、AS-IV通过TGF-β/Smad信号通路抑制外阴鳞癌细胞增殖、促进细胞。第二部分:方法:在体外,通过MTT法、平板克隆形成实验以及显微镜下细胞形态观察评估AS-IV的细胞毒性;Transwell和划痕愈合实验分析SW962细胞的迁移和侵袭能力;吖啶橙（AO）染色-荧光倒置显微镜观察SW962细胞发生上皮-间质转变的形态学变化;Western blot技术检测细胞迁移、侵袭以及TGF-β/FAK/AKT通路中关键蛋白的表达水平。结果:AS-IV（0-800μg/ml）以剂量依赖性的方式抑制SW962细胞的活力,24小时IC50为500μg/ml,同时伴随增殖相关蛋白:cyclin D1表达减少、P53和P21表达增多;当AS-IV给药剂量为200μg/ml时,SW962细胞形态发生改变,呈现异常萎缩、变小的不规则圆形,活细胞数量减少;而且细胞集落形成率明显降低,形态不完整。有趣地是,当给药剂量为100μg/ml时,对细胞的活力以及集落形成能力并没有明显影响;却对细胞的迁移和侵袭能力具有明显的抑制作用,同时伴随侵袭标志物（MMP-2、MMP-9）表达减少。此外,TGF-β1（10 ng/ml）培养SW962细胞24小时后,发现原本呈上皮样表型的SW962细胞,由椭圆形、簇状分布的形态逐渐转变为细长纺锤状成纤维细胞样,且细胞之间粘附减少、相互分散,上皮标志蛋白E-cadherin表达减少、间充质标志蛋白N-cadherin和Vimentin表达增多。我们还发现,TGF-β1处理条件下,FAK和AKT的蛋白磷酸化水平增高,而且MMP-2和MMP-9的蛋白水平上调,同时细胞的迁移和侵袭能力也明显增强。相反,当加入AS-IV后,TGF-β1诱导形成的成纤维样纺锤状细胞减少,N-cadherin、Vimentin、p-FAK、p-AKT,以及MMP-2和MMP-9的表达水平下调,E-cadherin表达上调,而且细胞迁移和侵袭能力明显减弱。结论:1、AS-IV能够抑制VSCC细胞的迁移和侵袭。2、AS-IV能够逆转TGF-β1介导的细胞EMT。3、AS-IV通过阻断TGF-β/FAK/AKT信号通路抑制VSCC侵袭转移。