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1.遗传性视网膜变性疾病的分子遗传学研究遗传性视网膜变性疾病(hereditary retinal degeneration,HRD)是一组与遗传因素密切相关、以原发性视网膜变性为主要病理改变、以视力和视野等视功能严重受损为主要临床表型的视网膜病变。HRD正逐渐成为国内外临床上常见且危害严重的致盲性疾病,也是难治性盲目的主要原因,然而临床上尚缺乏对其公认有效的治疗手段。基因治疗是目前研究的一大热点,但基因治疗的前提是精确的遗传诊断。HRD虽为单基因病,但却有着显著的遗传异质性,目前已明确的HRD致病基因就有240个,已知的连锁位点更是高达279个,因此,如何针对众多的致病基因开发高效、精确、可行的分子诊断新技术,并尽量控制成本是目前研究的主要方向。在第一部分研究中,我们旨在探索HRD患者的分子遗传学病因。我们构建了基于高通量二代测序(next-generation sequencing,NGS)的目标区域捕获测序平台,并借助该分子诊断平台在18个HRD家系中进行了遗传突变的筛查,明确了这些家系的致病基因,辅助了临床诊断,进一步扩展了突变的遗传和临床表型谱。此外,我们还对突变的基因型和表型间的关联进行了分析,发现了一系列新的基因型和表型间的关联。我们首次发现了USH2A、EYS基因突变与无色素性视网膜色素变性(retinitis pigmentosa sino pigmento,RPSP)疾病间的关联,首次发现了 MY07A基因突变与2型Usher综合征疾病间的关联,首次发现了 LCA5基因突变与视锥细胞变性(cone dystrophy,CD)疾病间的关联。综上,我们认为基于NGS平台的目标区域捕获测序能够在HRD家系中完成高效、精准的遗传突变筛查,而HRD的遗传诊断是了解感光细胞变性机制、辅助临床诊断、进行产前诊断和指导基因替代治疗的必要前提,有重要的基础/临床转化医学意义。2.发现视网膜色素变性新致病基因PRPF4及前体mRNA剪切基因缺陷的致病机制研究视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)以感光细胞的进行性凋亡为主要特点,并表现出极大的遗传异质性。目前已有报道指出U4/U6-U5小核核糖核蛋白三聚复合体(triple small nuclear ribonucleoprotein,tri-snRNP)相关的基因突变能够导致常染色体显性遗传的RP(autosomal dominant RP,ADRP),已知的致病基因包括 PRPF3、PRPF6、PRPF8、PRPF31 和 SNRNP200。其中,Brr2是由SNRNP200基因所编码的蛋白,是U5 snRNP的重要组成部分,在U4/U6小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)的解链过程中起着十分重要的作用。PRPF4基因编码了 Prp4蛋白,该蛋白是U4/U6小核核糖核蛋白二聚复合体(di-snRNP)的重要组成部分,能够维持U4/U6 di-snRNP的稳定性,然而PRPF4基因突变却尚未 HRD患者中被发现过。在第二部分研究中,我们首次发现了PRPF4基因突变与RP疾病间的关联,确认了 PRPF4是一个新的RP致病基因。我们在一个散发RP患者及一个ADRP家系中分别发现了 PRPF4 c.-114_-97del及p.Pro315Leu突变,并通过基于细胞及斑马鱼模型的一系列功能实验,证实了这两个PRPF4基因突变的致病性,在斑马鱼模型中确认了其所引起的视网膜疾病表型,并进一步明确了 PRPF4 c.-114_-97del及p.Pro315Leu突变能够分别通过单倍体剂量不足及显性抑制的机制致病。此外,我们还通过遗传学研究在两个RP家系中发现了 SNRNP200基因突变为其致病突变,并首次在在体实验中证实了 SNRNP200基因缺陷与视网膜特异性损害及RP疾病间的关联,并初步了解了SNRNP200基因缺陷引起剪切缺陷的作用机制。3.发现视网膜色素变性新致病基因SPP2及其致病机制研究RP以感光细胞的进行性凋亡为主要特点,并表现出极大的遗传异质性。全外显子组测序(whole-exome sequencing,WES)是指利用序列捕获技术将包括人类18134多个基因的全部CCDS区域捕获并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。该区域涵盖了蛋白质合成所需要的重要信息,涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异。WES可高特异性及高覆盖率的捕获全部基因的外显子区域,是一种高效的遗传测序策略,具有极大的优势。在第三部分研究中,我们借助WES技术,在一个四代ADRP家系中发现了 SPP2基因p.Gly97Arg突变,我们首次发现了 SPP2基因突变与RP疾病间的关联,确认了 SPP2是一个新的RP致病基因。SPP2 p.Gly97Arg突变所在的第97号氨基酸位点位于SPP2基因所编码的Spp-24蛋白的第二个高度保守的二硫键键环结构中,且该突变在800个正常对照的等位基因及包含1400个对照样本的WES内部数据库中均未被发现。我们进一步通过细胞及斑马鱼功能实验,证实了 SPP2突变的致病性,发现SPP2 p.Gly97Arg突变能够导致SPP2基因所编码的Spp-24蛋白的分泌障碍,降低Spp-24蛋白对蛋白水解酶的敏感性,引起Spp-24蛋白在内质网内的异常积聚,导致内质网应激反应而引起细胞功能障碍。此外,我们还在斑马鱼模型中发现SPP2基因突变能够导致视杆细胞及视网膜色素上皮细胞特异性的损害,并进一步明确了 SPP2 p.Gly97Arg突变能够通过显性抑制的机制致病。结论:我们借助了一系列遗传及功能实验,探索了 HRD的分子遗传学病因和发病机制,明确了患者的遗传诊断,辅助了临床诊断,揭示了新的基因型-表型间的关联,找到了 HRD的新致病基因,并进一步明确了其发病机制。