萌芽绿豆抗敏抗氧化活性物质分析及其作用机制研究

来源 :哈尔滨工业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tlswedu
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本论文基于植物化学、分析化学、药理学和分子生物学研究绿豆(Vigna radiatus Linn)萌芽过程中抗敏活性物质基础及其抗敏作用机理,考察活性成分代谢途径及外源性植物激素干预对活性成分代谢的影响。对绿豆SOD和CAT基因进行克隆和序列分析,并初步探讨绿豆SOD和CAT的酶活性与基因表达的相关性。将绿豆萌芽0-168h,每12h取出一组作为样品进行研究。通过体外透明质酸酶抑制实验和体内止痒实验,确定了抗敏活性较佳的绿豆萌芽时间为48h。通过正交实验得到的优化提取工艺及其数据是:80%乙醇回流提取,料液比为1:10,提取温度为50℃,提取时间为2h。采用不同溶剂对提取物进行萃取,乙酸乙酯层抗敏功效较佳,将该萃取物作为绿豆萌芽抗敏活性有效提取物。采用高效液相色谱串联质谱(HPLC/MS)技术定性鉴定出有效提取物中12种酚酸和6种黄酮类成分;通过液相色谱串联三重四极杆质谱(HPLC-QQQ/MS)技术定量分析有效提取物,其主要成分及其含量为:异牡荆素45.75mg/g、异槲皮苷193.52μg/g、山奈酚-3-O-芸香糖苷925.95ng/g、对香豆酸205.89μg/g。利用代谢组学研究手段,采用超高效液相色谱串联飞行质谱(UPLC-Q-TOF/MS)技术,准确鉴定出绿豆萌芽过程中21种多酚类物质,并发现多酚种类和含量呈现出随萌芽时间发生显著变化的规律;采用偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)分析不同时期萌芽中主要的差异性物质为8种黄酮类成分(牡荆素、异牡荆素、芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷、异槲皮苷、染料木素、大豆苷元、异鼠李素)和2种酚酸类成分(莽草酸、咖啡酸)。采用高效液相色谱(HPLC)方法,对8种黄酮类差异性物质进行了定量分析。从酚酸及黄酮类物质的变化规律中,总结归纳出绿豆萌芽过程中主要抗敏活性物质的代谢途径。采用被动皮肤过敏(PCA)、肥大细胞稳定性以及肥大细胞组胺释放实验动物模型有效地评价了萌芽绿豆抗敏有效提取物的抗敏活性,模型组与空白对照组比较均有极显著性差异(p<0.01)。当有效提取物为高、中剂量时,对上述三种模型均有显著功效;当有效提取物为低剂量时,对肥大细胞稳定性以及肥大细胞组胺释放实验两种模型有显著功效。研究结果表明:抗敏活性有效提取物通过抑制组胺释放缓解过敏反应导致的瘙痒,通过抑制被动皮肤过敏反应及增加肥大细胞稳定性,缓解过敏导致的红肿、泛红等现象。采用PMA联合钙离子载体诱导方法建立体外KU812嗜碱性细胞促炎细胞因子高表达模型,结果显示,经PMA和A23187诱导后,KU812细胞释放组胺、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8,使用异槲皮苷干预后,高、中、低剂量(50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL)的异槲皮苷均可显著抑制组胺释放和促炎细胞因子表达,且呈剂量依赖性。说明异槲皮苷可以通过抑制组胺和一系列促炎因子的释放减轻过敏反应中出现的皮肤病理损伤。同时,利用蛋白质印迹(Western blot)实验研究了异槲皮苷抗敏作用机理,异槲皮苷可显著降低丝裂原激活的蛋白激酶(MAPKs)通路细胞外信号调节激酶(ERK)的表达和核转录因子(NF-κB)通路NF-κB的活性。与此同时,采用同样的实验和方法,考察了萌芽绿豆有效提取物的抗敏机制,结果与异槲皮苷一致。异槲皮苷和萌芽绿豆有效提取物抗敏作用均是通过显著降低MAPKs通路ERK的表达和NF-κB通路NF-κB的活性实现的。通过研究7种植物激素对绿豆萌芽过程中活性成分的影响,筛选出MeJA对绿豆萌芽的影响最大,其较佳的使用浓度为1mmol/L。MeJA外源性干预可以显著提高24-72h萌芽总酚含量,进而提高萌芽抗氧化功效。萌芽168h对香豆酸和异牡荆素的含量相比于干预前分别下降了42.00%和85.85%;山奈酚-3-O-芸香糖苷、大豆苷元、染料木素、异槲皮苷和咖啡酸的含量相比于干预前均有不同程度的提高。说明MeJA外源性干预可以有效提高绿豆萌芽抗敏活性物质代谢水平,从而提高萌芽绿豆抗敏相关活性。采用分子生物学手段对绿豆的VirSOD和VirCAT进行基因克隆和序列分析,将绿豆SOD和CAT成功克隆所得DNA序列提交GenBank,获得到注册号为HQ259252、HQ259253和HQ260597、HQ260598。通过构建系统发育树可知:绿豆的VirSOD和VirCAT分别与其他豆科SODs和CATs聚为一个亚群。采用qRT-PCR的方法测定不同时期萌芽绿豆中VirSOD和VirCAT的表达,二者均在萌芽144h达到最高表达,此趋势与SOD和CAT酶活性变化规律吻合,说明萌芽过程中SOD及CAT酶活性增高与VirSOD和VirCAT的表达有关。
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