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超低温保存是目前种质资源经济、有效且永久保存的重要方法。但是仍有部分种质无法实现超低温保存或冻存后存活力较低,这种局限性很大程度上源于对超低温保存损伤机制的不完全了解。因此,解答超低温保存中的损伤机制可为揭示极端低温下生命现象提供理论基础,同时对超低温保存技术优化也具有重要意义。本研究以玻璃化超低温保存后再生率低(5.56%)的春石斛’红梦幻’(Dendrobium nobile Lindl.’Hamana Lake Dream’)类原球茎(PLBs)为试材,研究其在玻璃化超低温保存中蛋白质表达谱的变化,分析与PLBs在超低温保存中存活率变化相关的蛋白功能,并获得与PLBs存活率下降密切相关的关键差异蛋白。在此基础上,研究与活性氧(ROS)介导的氧化应激相关的关键差异蛋白在PLBs玻璃化超低温保存中的作用。主要研究结果如下:1)利用TTC染色法检测春石斛PLBs在玻璃化超低温保存程序中存活率下降的关键环节,结果显示各环节均造成PLBs细胞相对存活率不同程度地下降,其中PLBs存活率在预培养和冷冻-解冻环节下降最明显。利用透射电镜观察春石斛PLBs在玻璃化超低温保存程序中的细胞结构变化,结果显示玻璃化超低温保存程序会造成PLBs细胞结构明显的改变甚至破坏,但再生培养后多数细胞结构的改变可以恢复,呈现生活细胞的特征,说明细胞结构改变不是造成PLBs冻存后再生率低的主要原因。2)采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术探究春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序的各环节中的蛋白表达谱,共鉴定到1,747个蛋白质,其中在预培养、装载、PVS2处理、冷冻-解冻和去装载环节中差异表达的蛋白分别有14、17、82、108和63个,主要功能涉及蛋白质周转、碳水化合物与能量代谢、应激与防御以及膜与运输等,且这些蛋白的差异表达与PLBs在玻璃化超低温保存程序中的存活率变化有关。其中,与ROS代谢相关的差异蛋白在PLBs存活率下降幅度较大的预培养和冷冻解冻环节中所占比例较大,推测这些蛋白的差异表达与PLBs存活率明显下降有关。3)检测春石斛PLBs在玻璃化超低温保存程序的不同环节后ROS、氧化应激产物和抗氧化物质的变化,结果表明PLBs存活率下降最明显的预培养和冷冻-解冻环节是氧化应激爆发的关键环节。在玻璃化超低温保存程序的不同环节中添加非酶类ROS清除剂抗坏血酸(AsA)均可提高PLBs冻后存活率;在去装载环节添加0.1 mM AsA对PLBs冻后存活率提高效果最佳,可提高14.34%,检测此时氧化应激指标发现外源AsA可降低ROS水平、提高抗氧化能力并缓解膜脂过氧化损伤。结果表明,ROS介导的氧化应激与春石解PLBs玻璃化超低温保存中存活率的下降密切相关。4)将ROS代谢平衡相关的外源差异蛋白超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和丙酮酸脱氢酶(PDH)添加在春石斛PLBs玻璃化超低温保存程序的不同环节中,发现在去装载环节添加SOD、CAT和PDH均可显著提高PLBs冻后存活率,分别可提高5.76%、33.49%和2.49%,并不同程度地降低ROS水平和提高抗氧化物质含量;三者对内源SOD活性和丙二醛含量的影响不同,外源CAT对存活率的提高效果明显优于SOD和PDH,这是由于外源CAT在维持内源SOD的低活性时提高CAT活性更有利于降低ROS水平并减轻膜脂过氧化损伤。结果表明,ROS代谢平衡相关的差异蛋白可减轻春石斛PLBs玻璃化超低温保存中氧化应激的发生。5)为研究春石斛PLBs玻璃化超低温中ROS代谢相关差异蛋白的基因表达变化,首先利用荧光定量技术结合geNorm、NormFinder、Bestkeeper和qBase plus软件从春石斛PLBs的6个候选内参基因中筛选得到EF-1α和ACT基因可作为玻璃化超低温保存中基因表达研究的适宜内参基因。以该内参为参照,检测PLBs中14个ROS代谢相关差异蛋白的基因在玻璃化超低温保存程序中的表达,发现各环节均显著影响ROS介导的氧化应激与细胞凋亡相关基因的差异表达,且非酶类ROS清除剂AsA对PLBs超低温保存中损伤的缓解作用与其在转录水平减轻氧化应激和细胞凋亡有关。多数ROS代谢相关蛋白在玻璃化超低温保存中的表达与其基因表达变化不一致,可能与转录后、蛋白翻译和翻译后水平的调控有关。综上所述,本研究发现春石斛PLBs在玻璃化超低温保存中存活率的变化主要与蛋白质周转、碳水化合物与能量代谢、应激与防御以及膜与运输相关蛋白的差异表达有关,其中与ROS代谢相关的差异蛋白起关键作用。明确了 ROS介导的氧化应激与春石斛PLBs在玻璃化超低温保存中存活率的下降密切相关。验证了 3个ROS代谢平衡相关差异蛋白在春石斛PLBs玻璃化超低温保存中的积极作用。