镉(Cadmium,Cd)是一种高毒性的重金属元素,对植物的生长发育具有严重的危害作用。自然环境中的Cd含量通常很低,然而,随着工农业生产的快速发展,矿产开采冶炼和含Cd磷肥的使用等人类活动的扩张,均导致了土壤中重金属Cd污染的增加。水稻是人们重要的粮食作物之一,其品质安全对人们的身体健康至关重要。在水稻的生长过程中,Cd可以从Cd污染的土壤中被吸收进入根部和地上部分,严重影响其代谢、品质和安全。因此,减轻土壤中过量的Cd对水稻以及其他作物生长发育的毒害是科技工作者们研究的重要课题。ATP结合盒(ATP-binding cassette,简称ABC)蛋白是一类多样性的跨膜转运蛋白家族,广泛存在于从细菌到人类的各种生物体中。ABC转运蛋白主要通过水解ATP产生能量,完成底物的转运,包括激素、脂类、无机酸、谷胱甘肽复合物、多肽和重金属等。有研究报道,ABC转运蛋白在植物的Cd解毒过程中发挥着重要的作用。ABCG转运蛋白属于ABC转运蛋白家族的G亚家族。目前为止,关于水稻ABCG转运蛋白参与Cd解毒的研究还比较少。本研究主要通过CRISPR/Cas9基因编辑技术来构建水稻G型ABC转运蛋白基因OsABCG36的敲除突变体,并分析OsABCG36的时空表达模式、亚细胞定位、酵母中的转运活性以及其突变体植株的生理表型等来阐明OsABCG36在水稻中的生物学功能,主要得出以下结果:(1)OsABCG36在水稻的根和茎中均有较低水平的表达,但仅在根中经过Cd处理后其表达水平表现出明显的上调。在无Cd和含有Cd的情况下,OsABCG36基因在根尖(0-1 cm)和根基部(1-2 cm)的表达量均表现为一致。此外,OsABCG36受Cd诱导表达的程度随着Cd浓度的增加逐渐增强。Cd处理的时间梯度分析也发现,Cd能快速的诱导OsABCG36的表达,在3 h时其表达水平达到最高。这些结果说明,OsABCG36在水稻根中的表达是受Cd诱导的。(2)抗体免疫染色实验表明,在未加Cd的情况下,OsABCG36在根中具有低水平的表达。但是,在加Cd的情况下,除表皮细胞外OsABCG36在所有的根细胞中的表达均有明显的升高。(3)在水稻原生质体细胞中瞬时表达OsABCG36,结果显示GFP-OsABCG36的绿色荧光与细胞膜标记蛋白的红色荧光可以完全融合,说明OsABCG36定位于细胞质膜上。(4)在酵母细胞中表达OsABCG36时,带有pYES2-OsABCG36的酵母细胞在含Cd的SD-ura(Galactose)培养基上比带有空载体pYES2的酵母细胞生长得更好。Cd外排实验表明,随着时间的增加,带有pYES2-OsABCG36的酵母细胞比带有空载体pYES2的细胞积累了更少量的Cd。这些结果说明,在酵母细胞中OsABCG36能将Cd外排到细胞外,从而提高酵母对Cd的耐受性。(5)通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术,对水稻的ABC转运蛋白基因OsABCG36进行编辑,获得了两个不同突变位点的纯合突变株系,即osabcg36-1和osabcg36-2。Cd处理后突变体植株的相对根长与野生型相比明显变短,说明OsABCG36突变后降低了植株对Cd的耐受性,而OsABCG36突变后并不影响植株对Al、Cu、Zn和Pb的耐受性。此外,OsABCG36突变后导致了突变体植株根和根细胞液中Cd含量的增加。这些结果说明了OsABCG36在水稻根细胞中也具有外排Cd的功能,从而提高了水稻对Cd的耐受性。(6)对营养液培养的野生型和两个突变体植株使用不同浓度的Cd处理14天后发现,在无Cd和低浓度Cd(0.1、1μM)处理条件下,突变体植株根和茎的干重以及Cd含量与野生型相比,均无明显差异;在高浓度Cd(5μM)处理下,突变体植株与野生型相比根长明显变短,根的干重明显变少,根中的Cd含量明显增多,但是两者的地上部分无这些差异。此外,Zn、Cu、Fe和Mn的含量在两者间无明显差异,并且木质部汁液中的Cd浓度在两者间也无明显差异。这些数据表明,突变体植株根中含有更多的Cd可能是由于Cd不能排出到细胞外,导致Cd在细胞质中积累所造成的。但是,OsABCG36突变后不影响水稻苗期地上部分的生长以及Cd、Zn、Cu、Fe和Mn在地上部分的积累。综上所述,本研究结果表明OsABCG36定位于细胞膜上,通过将Cd或者Cd复合物外排出根细胞来参与水稻对Cd的耐受性。