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本研究选用苹果(MaluspumilaMill.)、梨(Pyrus.L)、桃(P.persicaBatch)和枣(ZiziphusjujubeMill.)4种山东主栽果树共53个品种作为试材,应用ALFP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism,扩增片段长度多态性)技术构建了这4个树种的DNA指纹图谱,并应用其DNA指纹图谱对试材进行了分子水平鉴定和遗传关系分析。
采取新鲜叶片作为果树基因组DNA的提取材料,采用改良CTAB法提取果树基因组DNA。其提取液成分为:3%CTAB,1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris.HCl(pH8.O),2%β-巯基乙醇。粗提后DNA经酚/氯仿/异戊醇抽提两次,除去蛋白质,经RNase除去RNA,最后用氯仿/异戊醇除去多余的RNase,得到了浓度大,基本无降解,蛋白质和RNA去除彻底,纯度高、质量好的果树基因组DNA。
通过对内切酶用量、酶切时间、连接时间、稀释倍数等的研究,建立了适于果树分析的AFLP银染技术体系。在50μL酶切连接体系中,含基因组DNA200-500ng,NEBBuffer25μL,BSA0.25μL,EcoRⅠ(20U/μL)0.25μL,MseⅠ(10U/μL)0.5μL,EcoRⅠ接头(adapter)(5pMol/μL)1.OμL,MseⅠ接头(adapter)(50pMol/μL)1.OμL,加无菌水ddH2O至50μL,37℃过夜;酶切连接产物进行预扩增,预扩产物稀释20倍进行选择性扩增,加入7μL上样缓冲液(Loadingbuffer),95℃变性5min,立即冰浴;在6.0%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析,银染法检测PCR产物。
从40对引物组合中筛选出8对引物组合对53个供试品种进行了扩增,初步构建了苹果、梨、桃和枣4种果树的AFLP指纹图谱。通过分析指纹图谱中品种的特异带,可以将烟富系的6个品系分成2组:烟富1号和2号为一组,烟富3号至6号为一组;可以将供试的21个梨品种和7个枣品种全部区分开。这体现出了AFLP在品种鉴定上的高效率,如继续筛选引物组合,可以区分开供试所有品种。
根掘构建的DNA指纹图谱,采用NTSYS软件计算简单匹配系数(Sm),进行分析,建立了苹果和桃2种果树品种的聚类分析树状图,分析了这2个树种的遗传多样性,初步揭示了树种内品种间的亲缘关系,为品种鉴定、种质资源保存及育种亲本选配,提供了理论依据。