目的:研究体内高同型半胱氨酸(Hcy)水平下,人神经管畸形(NTDs)胎儿脑组织蛋白质组的表达变化谱,并筛选差异表达蛋白。进一步在HTL诱导鸡胚模型和体外高HTL处理的小鼠神经干细胞(NE4C)模型中验证差异蛋白表达水平的变化。探究在高Hcy的NTDs样本中差异表达蛋白的变化,为临床上预防和降低NTDs缺陷儿的出生提供可能的试验依据。方法:一方面应用已有的人类NTDs库中高Hcy脑组织样本,采用基于质谱的同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术,筛选NTDs胚胎脑组织中的差异表达蛋白,通过生物信息学分析,进一步筛选到与NTDs发生相关的RNA结合蛋白,利用质谱平行反应监测(PRM)技术对目标蛋白进行绝对定量以验证其表达差异。另一方面,构建高同型半胱氨酸诱导的鸡胚NTDs模型,在E2期进行同型半胱氨酸代谢物同型半胱氨酸硫代内酯(HTL)的神经沟注射,在胚胎发育的E5时期收集正常组和HTL处理组鸡胚,利用PRM技术对RNA相关蛋白进行绝对定量以验证蛋白在两组中的差异。同时采用RT-PCR验证差异蛋白的mRNA水平,免疫组化验证差异蛋白的蛋白水平表达变化。另外在体外细胞水平上,应用5mM的HTL处理小鼠神经干NE4C细胞,用RT-PCR验证差异蛋白的mRNA水平,用WB及免疫荧光验证差异表达蛋白的表达变化。结果:(1)在人胚胎脑组织中共检测到6076种蛋白。通过对比高Hcy NTDs脑组织样本和正常对照组样本,共发现448个差异蛋白表达水平发生显著改变,其中表达水平上升的有214个,下降的有234个。经生物信息学分析,发现差异表达蛋白与RNA剪接、核糖体合成、RNA转运、RNA降解、mRNA监管等生物学过程相关,且RNA相关蛋白的表达呈下降趋势。(2)进一步在4例正常和4例NTDs样本中用PRM技术验证了差异表达蛋白的变化,发现六种蛋白(ALYREF,RBMX,HNRNPA1,HNRNPA3,HNRNPAB,EEF1A1)在NTDs样品中的水平显著降低,这与iTRAQ结果一致。(3)首次应用HTL鸡胚神经沟注射诱导获得鸡胚NTDs模型。(4)在HTL诱导的鸡胚NTDs模型中,经PRM分析,发现与剪接体相关的RNA结合蛋白HNRNPA1和HNRNPAB呈下降趋势,且mRNA表达水平也降低,免疫组化进一步确证HNRNPA1和HNRNPAB的低表达。(5)在HTL处理的NE4C细胞中,WB提示HNRNPA1和HNRNPAB的表达水平降低且mRNA表达水平也降低,免疫荧光提示HNRNPA1和HNRNPAB的细胞亚定位异常。(6)在NTDs胎儿脑组织中WB显示HNRNPA1和HNRNPAB的表达下降。结论:(1)提示高Hcy通过影响RNA代谢途径的HNRNPA1和HNRNPAB低表达可能是NTDs发生的新机制。(2)0.5mM HTL神经沟注射的新方法成功构建NTDs鸡胚动物模型。