【摘 要】
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MFS转运蛋白（major facilitator superfamily）的功能与许多生命活动息息相关,植物病原菌中关于MFS转运蛋白的系统研究尚比较匮乏。本论文在苹果树腐烂病菌基因组中鉴定了两个参与生物素转运的MFS转运蛋白VmVht1和VmVht2。研究发现,其编码基因在腐烂病菌侵染过程中显著上调表达,且VmVht1和VmVht2基因表达水平与生物素浓度呈剂量效应关系,随生物素浓度升高,基因
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MFS转运蛋白（major facilitator superfamily）的功能与许多生命活动息息相关,植物病原菌中关于MFS转运蛋白的系统研究尚比较匮乏。本论文在苹果树腐烂病菌基因组中鉴定了两个参与生物素转运的MFS转运蛋白VmVht1和VmVht2。研究发现,其编码基因在腐烂病菌侵染过程中显著上调表达,且VmVht1和VmVht2基因表达水平与生物素浓度呈剂量效应关系,随生物素浓度升高,基因表达量显著降低。为深入解析腐烂病菌MFS转运蛋白的生物学功能,通过PEG介导的原生质体转化对VmVht1和VmVht2基因进行了敲除和功能互补。成功获得了基因敲除体（ΔVmVht1和ΔVmVht2）,相比野生型菌株,ΔVmVht1和ΔVmVht2在PDA和苹果树皮培养基（ABM）中的菌落形态和生长速率无明显变化;而在察氏培养基（CDM）中菌落直径和菌丝干重均显著降低,在CDM中外源添加高浓度（2 mg/L）生物素可恢复ΔVmVht1和ΔVmVht2的生物学表型。VmVht1和VmVht2基因敲除后,腐烂病菌胞内生物素含量显著降低,此外,基因敲除可显著降低腐烂病菌的致病力,相比野生型菌株,基因敲除体在苹果枝条上的病斑长度分别减少63.9%和40.3%。进一步研究发现,ΔVmVht1和ΔVmVht2分泌β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶活性、产生原儿茶酸水平等也显著降低。表明MFS转运蛋白VmVht1和VmVht2通过调控生物素转运参与腐烂病菌致病。除生物素膜转运系统外,真菌体内也存在完整的生物素合成途径,而Bio2是生物素从头合成途径的关键酶。为明确合成途径在腐烂病菌生物素代谢中的作用,解析了腐烂病菌生物素合成酶Vm Bio2的生物学功能。基因表达分析表明,VmVht1和VmVht2敲除后,Vm Bio2表达量分别升高2.4和2.3倍,但在高浓度生物素条件下,Vm Bio2转录水平上调了13.0倍。Vm Bio2基因敲除体在3种培养基中的菌落形态和生长速率均无明显变化,且对苹果叶片和枝条的致病力相比野生型菌株也无显著差异。此外,获得了生物素转运蛋白VmVht1基因和合成酶基因Vm Bio2的双基因敲除体ΔΔVmVht1/Vm Bio2,发现其菌落形态、生长速率和致病力等表型均与单基因敲除体VmVht1无明显差异。由此推测,腐烂病菌获取生物素的主要途径是转运蛋白的主动运输,而从头合成途径仅是是辅助途径。生物信息学分析发现,酿酒酵母中报道的调控Vht1基因的转录因子在腐烂病菌中不存在功能同源蛋白,说明腐烂病菌中VmVht1和VmVht2基因的转录调控机制与模式真菌不同。据文献报道,RNA结合蛋白可作为转录因子或辅助因子调控基因转录,且酿酒酵母中转运蛋白Vht1与RNA结合蛋白Vts1存在直接互作。为深入探究VmVht1和VmVht2基因的转录调控机制,我们首先利用酵母双杂交验证了腐烂病菌转运蛋白VmVht和RNA结合蛋白VmVts1的互作关系。q PCR检测结果显示,RNA结合蛋白VmVts1编码基因表达水平随生物素浓度升高而降低,该基因敲除后腐烂病菌在PDA、AMB和CDM三种培养基中的生长速率均显著降低,且对苹果叶片和枝条的致病力也极度下降,分别降低71.6%和68.1%。研究还发现,VmVts1基因敲除体中,转运蛋白基因VmVht1和VmVht2的转录水平及胞内生物素含量均显著降低,推测VmVts1一方面通过与转运蛋白互作,参与VmVht1和VmVht2对生物素的转运;另一方面可以参与对VmVht1和VmVht2基因的转录调控,但具体机制还有待进一步研究。
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