各种原因造成的心脏做功的不断增加会导致心脏为满足心脏做功增加的需要而发生相应的适应性改变，即心肌肥厚。心肌肥厚在短时间内可维持或增加心输出量，然而，随着心肌肥厚的进展，会逐渐发展为失代偿性心肌肥厚，并出现心力衰竭。目前的心肌肥厚和心衰治疗方案均有一定的副作用，因此继续研究疾病的基本病因以便选择特异性的对因治疗方案和靶点具有特殊的重要性和迫切性。炎症细胞因子是细胞受内、外环境变化刺激后分泌的一组功能性蛋白分子,在众多炎症细胞因子中,起主要作用的是TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-10。炎症在循环系统疾病中发挥重要作用。炎症与高血压相互影响,互为因果。动脉粥样硬化(AS)是一种炎症性疾病,粥样斑块的发展和破裂导致ACS的全过程被认为是对损伤的炎性反映。流行病学证实,急性冠脉综合征(ACS)患者血清中与炎症有关的生物标志如C反应蛋白(CRP)、金属基质蛋白酶(MMPs)、白介素-6(IL-6)等升高,已被用于未来心血管事件发生的预测指标。炎症细胞因子级联反应对于心衰的发生、发展具有重要作用。研究表明,其可降低心肌收缩力及心输出量。心衰时炎症细胞因子增加,其水平是判断心衰严重程度及预后的指标,抗炎治疗可降低高危患者心衰的发生率。传统观点认为，脂肪组织单纯是一种贮备能量的器官。随着瘦素(leptin)、抵抗素(resistin)、脂联素(adiponectin)、网膜素(omentin)以及内脂素(visfatin)等大量脂肪组织分泌的血管活性物质的发现，脂肪组织的内分泌功能逐渐引起人们的重视。目前，脂肪组织作为一个内分泌器官的观点已成为学术界的共识，脂肪组织分泌各种血管活性物质统称为脂肪细胞因子。内脂素是一种新近发现脂肪细胞因子，并广泛表达在各种组织，这表明它具有多功能性。风湿性疾病、肥胖、糖尿病、急性肺损伤、自然分娩和感染诱发早产进程等病理生理情况下血浆内脂素水平明显升高。内脂素在心血管系统的作用也有很多报道：在急性冠脉综合征患者血浆内脂素水平明显高；内脂素与不稳定斑块之间密切相关，富含巨噬细胞的斑块中内脂素表达明显增高；内脂素能促进血管平滑肌细胞的成熟，促进血管重塑等作用。内脂素最初是从活化的外周血淋巴细胞的cDNA分离出来的，与B淋巴细胞的成熟有关。有研究发现，内脂素是一个重要的前炎性因子，在多种病理生理过程中发挥重要作用，内脂素可能是通过和一些尚未确认的受体结合或者通过特殊信号传导途径诱导炎症细胞因子的产生。此外，内脂素还可以诱导近小鼠循环中IL-6的水平增加。内脂素作为一种新的脂肪细胞因子，对它的的功能和作用仍然存在很多争议，内脂素的临床意义有待进一步研究。研究发现内脂素在循环系统中发挥的重要作用，但是大部分研究都集中于体内实验，有关内脂素体外研究尤其是在细胞水平的报道较少。目前有关内脂素在心脏细胞中的的表达，以及其在心肌细胞肥大中的作用及其机制的研究未见报道；而且，尚未见有关内脂素与心肌细胞炎症反应的研究。本研究目的是通过培养SD乳鼠原代心肌细胞，在细胞水平观察内脂素在心肌细胞肥厚以及心肌细胞炎症反应中的作用及其分子生物学机制。本研究主要包括以下四部分：第一部分内脂素在心肌细胞中的表达目的：成功提取并培养心肌细胞，观察心肌细胞是否表达内脂素，为后的进一步研究奠定基础。方法：购买出生2~3天的SD乳鼠，提取并培养原代心肌细胞，培养48h后换为无血清的培养基继续培养24h，之后应用RT-PCR、Western-Blot技术观察心肌细胞中内脂素表达情况。结果：心肌细胞中内脂素mRNA和蛋白均有表达。结论：心肌细胞能够表达内脂素。第二部分内脂素在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大中的表达及机制目的：建立心肌细胞肥大模型，观察在心肌细胞肥大过程中内脂素的表达情况，并进一步探讨内脂素变化的机制。方法：购买出生2~3天的SD乳鼠，提取并培养原代心肌细胞，培养48h后换为无血清的培养基继续培养24h，之后应用Ang II干预心肌细胞。然后，分别应用Ang II1型受体阻断剂——替米沙坦和Ang II2型受体阻断剂——PD123319被用于阻断Ang II的作用，随后应用Ang II1型受体下游信号通道阻断剂SP600125、AG490和U0126进一步阻断Ang II作用。应用RT-PCR、Western-Blot技术检测心肌细胞中内脂素表达情况，应用Western-Blot技术检测心肌细胞BNP表达情况。应用MTT法检测心肌细胞活力。结果：在Ang II的干预下，心肌细胞内脂素和BNP的表达随着Ang II干预浓度和干预时间的延长而增加。mRNA和蛋白在Ang II10-5mo1/L干预48h后达到最高值，P＜0.01。BNP蛋白水平随Ang II浓度的升高和干预时间的延长而增加，P＜0.01。替米沙坦完全阻断了Ang II诱导的内脂素表达增加。内脂素mRNA和蛋白表达水平，AG490+Ang II组、SP600125+AngII组和U0126+Ang II组明显低于Ang II组，但是明显高于正常对照组，AG490+Ang II组明显低于SP600125+Ang II组和U0126+Ang II组，P＜0.01。结论：在Ang II诱导的心肌细胞肥大中内脂素表达的增加，由AT1-R-JAK/STAT信号通路介导。第三部分内脂素通过Rho/Rock2-NF-κb信号通路引起心肌细胞肥大目的：观察内脂素对心肌细胞肥大的影响，以及内脂素是否是引起心肌细胞肥大的独立因素，并相关的机制；方法：购买出生2~3天的SD乳鼠，提取并培养原代心肌细胞，培养48h后换为无血清的培养基继续培养24h，同时进行分组。内脂素阻断剂FK866被用来阻断Ang II诱导的心肌细胞肥大中增加的内脂素的作用。应用重组内脂素干预心肌细胞，随后应用RhoA/ROCK-NFκB信号通道阻断剂：辛伐他汀、Y27632、SN50，阻断上述信号通道。应用real time-PCR、Western-Blot技术检测心肌细胞BNP表达情况，并检测心肌细胞表面积以判断心肌细胞肥大情况；应用Western-Blot技术检测心肌细胞RhoA、ROCK2、IκB-α和SIRT1蛋白水平，应用细胞免疫组化观察NF-κb核转位情况。结果：FK866的预干预后，心肌细胞BNP蛋白水平较未经FK866预处理的AngII干预组明显降低，但仍明显高于正常对照组，P<0.05。100ng/ml内脂素干预48小时后心肌细胞的表面积和BNP mRNA、蛋白水平达到峰值，P<0.05。随着内脂素干预浓度的增加和干预时间的延长，心肌细胞RhoA和ROCK2蛋白水平随之升高，100ng/ml内脂素干预48小时后达到峰值，P<0.05；与之相反，IκB-α蛋白水平随着内脂素干预浓度的增加和干预时间的延长而降低，100ng/ml内脂素干预48小时后达到最低值，P<0.05。应用细胞免疫组化鉴定发现，与正常对照组相比较，100ng/ml内脂素干预48小时后心肌细胞NF-κb大量从胞浆转位至胞核中。在辛伐他汀、Y27632和SN50的作用下，心肌细胞的表面积、BNP mRNA水平均明显低于100ng/ml内脂素干预组，但高于正常对照组。随着内脂素干预浓度的增加和干预时间的延长，心肌细胞SIRT1蛋白水平随之升高，100ng/ml内脂素干预48小时后达到峰值，P<0.05。在辛伐他汀和Y27632预干预组，心肌细胞ROCK2蛋白水平明显低于100ng/ml内脂素干预组，IκB-α蛋白水平明显高于100ng/ml内脂素干预组，均较正常对照组没有明显差异。在SN50预干预组，心肌细胞IκB-α蛋白水平明显高于100ng/ml内脂素干预组，较正常对照组没有明显差异；ROCK2蛋白水平明显高于正常对照组，与100ng/ml内脂素干预组相比没有明显差异。应用细胞免疫组化鉴定发现，辛伐他汀和Y27632预干预组中NF-κb核转位现象较之内脂素干预组明显减少。结论：内脂素可以通过RhoA/ROCK2-NFκB信号传导通路引起心肌细胞肥大，SIRT1在其中发挥重要作用。第四部分RhoA/ROCK-NFκB通路介导内脂素诱导的心肌细胞炎症反应目的：观察内脂素是否可以引起心肌细胞的炎症反应，并探讨相关机制。方法：购买出生2~3天的SD乳鼠，提取并培养原代心肌细胞，培养48h后换为无血清的培养基继续培养24h，同时进行分组。分为：(1)正常对照组、重组内脂素10ng干预24h、重组内脂素50ng干预24h、重组内脂素100ng干预24h；(2)正常对照组、重组内脂素干预12h、重组内脂素干预24h、重组内脂素干预48h、重组内脂素干预72h；(3)正常对照组、重组内脂素干预组、SN50组、SN50组+重组内脂素组；(4)正常对照组、重组内脂素干预组、Y27632组、Y27632+重组内脂素干预组、辛伐他汀组、辛伐他汀+重组内脂素干预组；(5)正常对照组、重组内脂素干预组、sirtinol组、sirtinol+重组内脂素干预组。应用real time-PCR检测心肌细胞TNF-α mRNA水平，应用MTT法检测心肌细胞活力。结果：在完成第三部分实验的同时，又观察了在内脂素的作用下心肌细胞炎症因子TNF-α的变化。发现，在100ng/ml内脂素干预心肌细胞48小时后TNF-α mRNA水平达到峰值。心肌细胞MTT产物的OD值在内脂素浓度为10ng/ml时候达到峰值，在内脂素浓度为50ng/ml时明显低于10ng/ml组，且略低于对照组，但与对照组相比未见明显差异，在内脂素浓度为100ng/ml时候明显下降，甚至明显低于正常对照组。应用100ng/ml内脂素干预心肌细胞，在早期心肌细胞MTT产物的OD值与对照组相比未见明显差异，24h后明显低于对照组，48h后有继续降低的趋势，但与24h组相比未见明显差异。sirtinol干预组心肌细胞MTT产物的OD值明显低于对照组，但高于单纯100ng/ml内脂素干预组。结论：内脂素可以通过RhoA/ROCK2-NFκB信号传导通路引起心肌细胞炎症反应。内脂素诱导的SIRT1表达的适度增加具有减弱炎症因子对心肌细胞损害的作用。内脂素诱导的炎症因子表达的增加参与心肌细胞肥大性生长。