目的:通过体内体外实验验证CSPⅠ-plus修饰的内皮抑制素(rES-CSP)抑制肝细胞癌转移的作用,并初步探讨rES-CSP抑制肝细胞癌转移的可能机制,以期为肝细胞癌转移的治疗提供实验依据与药物开发思路。方法:1、利用大肠杆菌E.col BL21(DE3)原核表达系统表达rES-CSP重组蛋白及可溶性表达条件(诱导温度和时间)的优化。2、利用HisTrapTMHP亲和层析柱进行可溶性重组蛋白的纯化;通过RP-HPLC和BCA试剂盒检测其纯度和浓度。3、以CSPⅠ-plus和Endostar作为对照,通过CCK-8实验检测不同浓度rES-CSP的活性;细胞划痕、Transwell及黏附实验检测各组对高转移肝癌细胞HCCLM3迁移、侵袭及黏附的作用。4、慢病毒转染法将带有荧光素酶(Luc)基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒转染到HCCLM3细胞株;用嘌呤霉素筛选转染后的HCCLM3细胞,并通过ATP荧光检测仪检测荧光素酶的活性,荧光显微镜观察GFP的表达情况。获得同时表达Luc和GFP的双标高转移肝癌细胞株Luc-GFP/HCCLM3。5、取对数生长期的标记Luc和GFP的HCCLM3细胞肝原位直接注射,建立裸鼠原位肝癌模型。6、实验分为①生理盐水对照组,②Endostar组,③rES-CSP组。尾静脉隔天给药,连续用药50天。每周采用动物活体成像技术实时动态观察各处理组裸鼠肝原位肿瘤生长及肝脏肿瘤转移情况。7、将成像8周后的各组裸鼠安乐死处理,病理解剖观察各处理组对裸鼠肝原位肿瘤生长及转移情况。剥离肝原位瘤块测量肿瘤体积、重量并计算抑瘤率及肺转移率。同时取裸鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肿瘤做组织切片。8、HE染色观察rES-CSP对肿瘤及转移灶形态学影响和裸鼠各脏器的毒副作用。9、实时荧光定量PCR法检测rES-CSP对HCCLM3细胞血管生成因子和转移相关分子mRNA表达的影响。10、蛋白质免疫印迹法检测rES-CSP对HCCLM3细胞血管生成因子和转移相关分子蛋白表达的影响。11、免疫组织化学法检测rES-CSP对肿瘤组织及转移灶血管生成因子和转移相关分子蛋白表达的影响。结果:1、获得纯度和浓度都较高的rES-CSP可溶性重组蛋白。2、体外实验表明:与空白对照组、CSPⅠ-plus和Endostar相比,rES-CSP具有抑制HCCLM3细胞增殖、迁移、侵袭及黏附的作用。3、通过鉴定显示Luc和GFP标记的高转移肝癌细胞株构建成功。4、裸鼠原位肝癌模型成功建立。利用活体成像系统连续观察原位肝癌模型组裸鼠,随着时间延长,荧光信号逐渐增强。与生理盐水、Endostar组相比、rES-CSP组随着时间延长腹部发光减弱显著,实体观察显示rES-CSP和Endostar组的人肝癌裸鼠荷瘤的抑瘤率分别为42.4.6±5.39%和11.1 ± 1.88%。另外,HE染色表明重组蛋白能促使肿瘤坏死,抑制肿瘤血管的生成。5、组织生物发光表明与生理盐水、Endostar组相比、rES-CSP组肝原位和肺转移灶生物发光信号明显减弱。实体观察显示对照组、Endostar组、rES-CSP组肺转移率分别为71%、50%、42.8%。另外,肺转移灶HE染色结果提示重组蛋白能抑制肿瘤细胞浸润生长。6、HE染色验证了 rES-CSP对裸鼠各重要脏器无明显毒副作用。7、与对照组相比,rES-CSP使肝癌细胞血管生成因子VEGF的蛋白表达下调,CSP I-plus的竞争抑制剂肝素钠作用后VEGF表达上调。另外,rES-CSP使肝癌细胞转移相关分子integrinβ1和MMP2的蛋白表达下调,而E-cadherin蛋白表达没有明显变化。肝素钠作用后MMP2和integrinβ1表达上调。8、与对照组相比,rES-CSP使肿瘤组织血管生成因子VEGF、转移相关分子MMP2和integrinβ1蛋白的阳性表达降低,而E-cadherin蛋白阳性表达没有明显变化。肺转移灶中各处理组转移相关分子E-cadherin、integrinβ1和MMP2蛋白表达没有显著差异。结论:1、体外实验验证rES-CSP可溶性重组蛋白具有抑制高转移肝癌细胞HCCLM3转移的作用;2、建立了双荧光标记的裸鼠原位肝癌模型,体内实验验证rES-CSP可溶性重组蛋白具有抑制肝原位肿瘤生长的作用及抑制肝脏肿瘤的肺部转移能力;3、初步确定了 rES-CSP可能是通过下调血管生成因子VEGF,转移相关分子integrinβ1和MMP2发挥抑制肿瘤生长和转移的作用,也可能通过干扰肝癌细胞表面HSPG介导的肿瘤迁移发挥抑制肝癌转移的作用。