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研究目的:子宫内膜异位症(endometriosis,EMS)被喻为21世纪困扰妇女的疑难病,育龄妇女罹病者占10%的,其发病机制尚不完全清楚,西医目前尚不能彻底根治。面对内异症的高发生率和高复发率,其诊治已经成妇产科学界研究的热点问题。人们试图寻求多方位多靶点的治疗,中医药的介入也成为众所关注的话题。活血化瘀法成为基本的公认的治疗大法,然而子宫内膜异位症这种属于激素依赖性疾病,其病理变化较为固定,发生机制却相当复杂,至今未明。我们在长期的临床实践中,运用夏桂成教授的补肾调周法治疗女性内分泌紊乱性疾病取得了较好的效果,因此我们设想在以补肾为主的前提下结合软坚化瘀方法能从源头上调控子宫内膜异位症的内环境紊乱状态,干预子宫异位内膜形成的“侵袭”过程,从而达到标本兼治的目的。本研究从分析EMS的形成过程入手,把握内异症病理“3A”过程的重要环节,着眼于“侵袭”过程形成的相关因素,从模型动物的实验方面探讨补肾序贯方(包括滋阴汤和补阳汤)结合软坚化瘀方(散结镇痛方)对EMS大鼠异位内膜组织的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(TIMP-2)及其mRNA表达的影响,研究比较各治疗组、模型组异位内膜组织及正常组在位内膜组织中上述分子表达的差异,印证MMP-2及TIMP-2在内异症发病中的作用;试图从蛋白及分子水平探讨补肾序贯结合软坚化瘀中药对EMS大鼠异位内膜侵袭的影响以及中药治疗EMS的细胞分子机制,阐明补肾序贯结合软坚化瘀法调控EMS大鼠异位内膜的作用优于单纯使用补肾序贯法或软坚化瘀法,展示标本兼治立方旨意的效用,为寻求子宫内膜异位症有效的治疗方法提供实验依据。另外,本实验研究拟从光镜及电镜下观察比较各治疗组对EMS大鼠的组织病理形态学的改变,从病理形态学上验证软坚化瘀结合补肾序贯方对EMS大鼠的治疗作用,为软坚化瘀及补肾序贯方治疗内异症提供组织病理形态学实验依据。研究方法:采用自身内膜种植方法建立大鼠子宫内膜异位症模型,在模型建立成功的基础上,根据大鼠的发情周期给EMS大鼠灌服补肾序贯结合软坚化瘀方(混合组)治疗,同时设补肾序贯组、软坚化瘀组、正常组、模型组为对照组。治疗4周后择动情期处死大鼠,留取各组异位或在位子宫内膜标本备测。1.观察其病理组织形态学的改变2.采用免疫组化法从蛋白水平检测EMS大鼠在位内膜及异位内膜组织中MMP-2、TIMP-2的分布、相对含量3.采用Real-time PCR法从核酸水平对EMS大鼠在位内膜及异位内膜组织中MMP-2 mRNA、TIMP-2 mRNA的表达情况进行检测。应用SPSS11.5(Statistical Package for the Social Science.11.5)统计分析软件对实验数据进行统计分析。结果1.病理学研究结果病理组织学提示,正常对照组的大鼠在位子宫内膜腺上皮呈柱状,内膜腺体较丰富。模型组异位子宫内膜粘膜上皮呈柱状,内膜腺体较稀少,腺腔大,有上皮分泌,周围血管扩张,边界有陈旧性出血,纤维组织增生,间质内炎性细胞多见。各治疗组异位内膜变薄,内膜粘膜表面为立方上皮、矮立方上皮或单层扁平上皮,内膜组织腺体数量减少,腺腔变小,血管管腔不扩张,未见含铁血黄素沉积,其中混合组异位内膜极薄,细胞萎缩多呈矮立方上皮或单层扁平上皮,效果较其它治疗组更明显。电镜观察显示,正常对照组子宫内膜上皮细胞呈柱状,排列紧密,近腔面可见细胞之间的紧密连接细胞腔面微绒毛密集;腺上皮细胞界线清楚,形态大小正常;细胞核形态规则,核膜界线清楚;胞浆内含有较多线粒体,发育良好;粗面内质网和溶酶体较少;核位于基底部,核膜光滑,异染色质分布均匀。模型组子宫内膜上皮细胞排列紧密,细胞之间可见连接复合体发育良好;腺腔狭窄,微绒毛部分脱落;细胞界线基本清晰,胞浆内含较多线粒体;粗面内质网较少;核膜界线清晰,局部出现凹凸切迹,少数异染色质集聚靠近核膜。各治疗组子宫内膜上皮细胞立方状,排列紧密,细胞之间的连接复合体发育较差;细胞腔面微绒毛稀少;胞浆内含较多线粒体,多数肿胀呈圆形,嵴多消失,基质空亮;粗面内质网和溶酶体较少;核位于基底部,核膜出现多个凹陷性深切迹,异染色质分布均匀。其中混合组细胞界线不清,胞核固缩明显。2.免疫组化结果MMP-2通常在子宫内膜腺上皮细胞中表达,而正常组的大鼠子宫内膜几乎无MMP-2的基础表达。而EMS大鼠异位内膜的MMP-2表达显著高于正常在位内膜(P＜0.01),并在腺上皮细胞及间质细胞中都有分泌。与正常组相比,模型组MMP-2的染色范围显著增加,染色加深,呈高表达。各治疗组MMP-2的染色范围较模型组缩小,呈散在分布,染色变淡,表达下降,其中混合组及软坚化瘀组效果明显,与模型组的表达相比有显著差异(P＜0.05),而混合组的表达最低。TIMP-2亦较多分布于正常子宫内膜的间质细胞和腺上皮细胞中,表达较高;在EMS大鼠异位内膜的间质细胞和腺上皮细胞胞浆中亦有少量分布。与正常组相比,模型组的TIMP-2的染色范围明显缩小,染色变浅,表达明显低于正常组在位内膜TIMP-2的表达(P＜0.01);各治疗组TIMP-2的染色范围较模型组增加,染色加深,表达增加,其中混合组和软坚化瘀组效果明显,与模型组相比有显著性差异(P＜0.05),而混合组的表达最强。研究结果显示:补肾序贯方、软坚化瘀方均能不同程度减少EMS大鼠异位内膜组织中MMP-2的表达,提高TIMP-2的表达,改善MMP-2/TIMP-2比值的失衡状态,而补肾序贯结合软坚化瘀方干预效果最佳。3.Real-time PCR研究结果:正常组的大鼠在位子宫内膜有少量MMP-2 mRNA与TIMP-2 mRNA的基础表达,模型组异位内膜的MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA的含量均明显高于正常组,虽然TIMP-2 mRNA随着MMP-2 mRNA的升高而升高,但两者的升高幅度并不一致,正常组大鼠在位内膜的TIMP-2 mRNA含量高于MMP-2 mRNA含量,而模型组大鼠异位内膜的TIMP-2 mRNA含量却低于MMP-2 mRNA含量,其他各治疗组亦在不同程度上降低了MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA的比值,推断MMP-2 mRNA/TIMP-2mRNA的相对增高可能导致了MMP-2/TIMP-2的相对增高,MMP-2/TIMP-2的失衡从而引起异位症的发生。通过降低MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA的比值,改善MMP-2/TIMP-2的失衡状态,减弱异位内膜的侵袭性,从而达到治疗内异症的目的。研究结果显示:软坚化瘀组及补肾序贯组异位内膜中MMP-2 mRNA的表达量均较模型组下降,其结果与免疫组化结果基本相符,推测两组中药可能可以通过影响核酸水平的表达进而调控其蛋白水平的表达。但混合组的MMP-2 mRNA含量却明显高于模型组,未显示出假设的治疗效果,其数据异常增高,与其它组相比偏离太大,初步分析认为此数据可信度不够,可能为多方面因素造成。结论:1.本实验研究成功复制了EMS大鼠模型,并经光镜、电镜验证显示内异症异位内膜组织发生明显的病理学改变;而补肾序贯结合软坚化瘀方可以较显著改善病变局部的病理变化,影响其免疫病理效应,从而达到治疗本病的目的;2.推论MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA的失衡可能是导致内异症发生的重要因素,MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA的相对增高可能导致了MMP-2/TIMP失衡从而引发内异症;3.补肾序贯结合软坚化瘀法在蛋白水平上可以降调MMP-2和TIMP-2,改善MMP-2/TIMP-2的失衡状态,从而降低异位内膜的侵袭性,阻断其种植过程,达到治疗本病的目的,在核酸水平上是否有降调的作用,有待于进一步的研究印证;4.本研究从动物实验方面阐明补肾序贯结合软坚化瘀法干预了EMS大鼠异位内膜形成的“侵袭”过程的作用,展示了此法标本兼治立方旨意的效用,为寻求子宫内膜异位症有效的治疗方法提供实验依据,有很好的临床推广价值。