炎症反应是机体免疫系统针对外界刺激如感染和组织损伤而产生的一种复杂的生理性反应,由趋化因子、细胞因子、脂类炎症介质等参与。巨噬细胞是炎症反应的主要效应细胞,激活的巨噬细胞在炎症开始后迅速抵达炎症部位,参与吞噬病原体和分泌各种参与炎症反应的介质和细胞因子。炎症反应中所产生的大量炎症介质在有效清除病原体的同时,也可造成正常细胞和组织的病理性损伤。因此,对炎症反应这把机体防御双刃剑的有效调控就显得尤为重要。MicroRNAs (miRNAs)是一类非蛋白编码的小RNA,长度为18-25nt。它通过结合靶基因mRNA的3’UTR (untranslated region)而抑制基因的表达,表现为一种转录后调控基因表达的全新机制,在发育、免疫应答、炎症反应及肿瘤发生发展等生理与病理过程中均发挥重要调控作用。迄今为止,已有一些miRNAs被证实参与炎症反应的调控。然而,我们知道,miRNAs对生物过程的调控通常是以多miRNAs与多靶基因相互协同交错的网络形式完成。因此,对于众多其他miRNAs是否参与炎症反应的调控及其如何参与这一过程等问题,仍有待广泛研究加以揭晓。miR-34a是功能强大的抑癌样miRNAs之一,因其显著的肿瘤抑制功能而在多种类型肿瘤中被广泛研究。由于miRNAs的表达及功能异常是联系炎症与肿瘤的众多纽带之一,miR-34a与肿瘤的密切相关性是否预示着其在炎症反应中也发挥着重要调控作用?然而,迄今为止,有关miR-34a在炎症反应中的调控作用仍未见报道。基于以上研究背景,我们以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激巨噬细胞建立炎症模型,首次研究了miR-34a在炎症反应中的作用,旨在阐明：1)miR-34a是否参与巨噬细胞炎症应答的调控；2) miR-34a以何种机制参与巨噬细胞炎症应答的调控。第一部分miR-34a抑制巨噬细胞炎症应答首先,我们检测了巨噬细胞炎症应答中miR-34a的表达变化。结果发现,单核巨噬细胞系RAW264.7经LPS刺激后,miR-34a的表达显著下降,而且这种下降呈现出对LPS的剂量依赖性。同样,原代巨噬细胞和人单核细胞系THP-1经LPS刺激后也表现出miR-34a表达下调。因此,LPS刺激可下调单核巨噬细胞中miR-34a的表达水平。miR-34a在巨噬细胞炎症应答中表达下调,那么miR-34a本身在巨噬细胞的炎症应答过程中有何生物学意义?随后,我们分别利用成熟miR-34a模拟物(miR-34a mimics)过表达和miR-34a抑制剂(miR-34a inhibitor)下调巨噬细胞内源miR-34a的水平,并检测巨噬细胞炎性因子分泌情况的变化。结果显示,miR-34a模拟物可显著抑制巨噬细胞经LPS刺激后主要炎性因子TNF-α(?)IL-6的mRNA和蛋白水平的表达。相反,miR-34a抑制剂却显著促进了巨噬细胞对LPS刺激的炎性应答。由此我们可以得出结论,miR-34a可负性调控巨噬细胞对LPS刺激所产生的炎症应答。第二部分miR-34a通过靶向作用Notchl抑制巨噬细胞炎症应答鉴于miRNAs以靶向作用靶基因的方式参与生物过程的调控,我们接下来研究miR-34a是通过作用于哪个或哪几个靶基因而发挥抑制巨噬细胞炎症应答的作用。我们使用Target Scan及miRanda等数据库对miR-34a的潜在靶基因进行预测核分析,并锁定Notchl为进一步研究对象。Notch信号通路在调控免疫细胞发育和分化过程中发挥关键作用,并已被证实参与调控巨噬细胞的炎症应答过程。因此,我们猜测：miR-34a对巨噬细胞炎症应答的抑制作用可能是通过靶向作用Notchl而完成。通过生物信息学软件预测,我们发现miR-34a在Notchl的3’UTR有一个序列保守的潜在的靶位点。为了验证miR-34a及Notchl的相关作用关系,我们构建了含Notchl3’UTR结合序列的报告基因质粒。双荧光素酶活性实验发现,miR-34a可显著抑制Notch13’UTR结合序列的报告基因质粒的荧光素酶活性。此外,实时定量PCR (real time PCR)及免疫印迹(western blot)分析结果显示,巨噬细胞内Notch1的mRNA水平和蛋白水平表达均受到miR-34a的抑制。对Notch通路下游靶基因Hes1和Hey2的mRNA水平的分析证实,Notch信号通路的活化受到了miR-34a的抑制。由此我们可以得出结论,miR-34a可通过与Notchl3’UTR的直接相互作用而下调巨噬细胞内Notchl的表达水平,从而抑制Notch信号通路的活化。为了验证Notchl通路在miR-34a抑制巨噬细胞炎症应答中的作用,我们分别用siRNA干扰技术和抑制剂干扰Notchl的表达、抑制Notch信号通路,并观察其对LPS诱导的巨噬细胞炎症应答的影响。结果显示,干扰Notchl表达之后,巨噬细胞经LPS刺激所产生的TNF-α和IL-6等炎性因子在mRNA水平和蛋白水平均呈现显著下降,与miR-34a作用效果相似。用抑制剂抑制Notch信号通路后,也得到相似的结果。因此,我们认为miR-34a可通过抑制Notchl的表达而负性调控巨噬细胞炎症应答。第三部分miR-34a抑制巨噬细胞炎症应答过程中NF-κB通路的活化转录因子NF-KB调控诸多炎症分子的表达,也是Notch信号通路调控巨噬细胞炎症应答的重要分子机制。为进一步研究NF-KB在miR-34a抑制巨噬细胞炎症应答中的作用,我们利用双荧光素酶活性实验检测了miR-34a对NF-KB转录活性的影响,并采用免疫荧光法检测miR-34a对NF-KB p65转核的影响,利用westernblot分析了miR-34a过表达后NF-KB通路的活化情况。结果显示,miR-34a可抑制NF-KB启动子报告基因质粒的荧光素酶活性；LPS刺激引起的巨噬细胞内p65转核、p65磷酸化以及IKBα降解均受到了miR-34a的显著抑制。因此,miR-34a可抑制巨噬细胞炎症应答过程中NF-κB通路的活化。结论：1) miR-34a制巨噬细胞经LPS刺激后的炎性因子分泌,负性调控巨噬细胞的炎症应答；2) miR-34a靶向作用Notchl,抑制Notch言号通路的活化,从而负性调控巨噬细胞的炎症应答；3) miR-34a抑制巨噬细胞炎症应答过程中NF-KB通路的活化,从而抑制巨噬细胞的炎症应答。