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真菌性水（脓）疱检测体系建立与验证背景浅部真菌病是由真菌感染引起皮肤角质层、皮肤附属器的结构破坏并伴有不同程度的宿主免疫反应的疾病。在皮肤科,皮肤真菌病是常见的浅部真菌病。皮肤真菌病中,有一部分皮肤真菌病呈水（脓）疱样表现,包括水疱型手足癣、体股癣、癣菌疹及水疱样表现难辨认癣等[1]。这些有水（脓）疱样表现的皮肤真菌病,容易与常见的水（脓）疱性疾病产生混淆,尤其是水（脓）疱样表现出现在婴幼儿、失能人群、不能准确叙述病史的患者身上时。此时,我们更需要进行真菌学辅助诊断检查以帮助判断是否为真菌感染,以指导临床诊断。皮肤病的成功治疗依赖于准确的诊断。传统的辅助诊断方法是收集皮屑、指甲和毛发标本,通过真菌镜检、真菌培养等方法进行真菌检测。对于有水疱或（和）脓疱表现的皮肤真菌病,能否通过对其采集疱液标本进行真菌学检验,判断疱液中是否含有真菌及所含真菌的种类,值得探索。目的通过采集疑似真菌感染患者的疱液和皮屑标本,进行真菌荧光镜检、真菌培养和真菌PCR检测,建立真菌性水（脓）疱的检测体系,验证并探讨疱液标本通过直接镜检、真菌培养和PCR在真菌感染诊断中的价值。方法1.采用真菌荧光镜检、真菌培养和PCR建立真菌性水（脓）疱检测体系。2.纳入2020年7月-2021年7月我院（上海市皮肤病医院）真菌科34例有水（脓）疱表现疑似真菌感染的患者,通过真菌性水（脓）疱检测体系检测34例患者的疱液标本,同时取同一患者疱周的皮屑标本作为对照。将“患者疱液和（或）皮屑通过真菌镜检、培养和PCR三种方法中的两种或两种以上为阳性视为真阳性”作为金标准,观察并评价三种检测方法在疱液标本和皮屑标本中的差异,比较疱液标本和皮屑标本诊断真菌感染的差异,验证真菌性水（脓）疱检测体系效果。结果1、真菌性水（脓）疱检测体系的建立通过真菌荧光镜检,能够在疱液标本中检出真菌菌丝或孢子;通过真菌培养,疱液标本能够培养出真菌菌落;通过真菌PCR,能够检出疱液标本中的真菌病原体种类。2、真菌性水（脓）疱检测体系的验证2.1、患者流行病学情况纳入研究有水（脓）疱表现的疑似真菌感染患者共34例,其中男18例,女16例,年龄为8～84岁。患者的水（脓）疱多位于趾（指）间和（或）足（掌）跖;73.53%的患者接受了局部药物治疗。2.2、真菌镜检在真菌荧光镜检中,疱液标本阳性20例（58.82%）,皮屑标本阳性23例（67.65%）,疱液标本和皮屑标本均为阳性16例（47.06%）,皮屑标本阴性而疱液标本阳性4例（11.76%）,皮屑标本阳性而疱液标本阴性6例（17.65%）。2.3、真菌培养通过真菌培养,疱液标本检出阳性2种真菌14例（41.18%）,皮屑标本检出阳性2种真菌8例（23.53%）,疱液标本和皮屑标本均为阳性7例（20.59%）,皮屑标本阴性而疱液标本阳性7例（20.59%）,皮屑标本阳性而疱液标本阴性1例（2.94%）。2.4、真菌PCR及测序通过PCR,检出疱液标本阳性22例（64.71%）,皮屑标本阳性10例（29.41%）,疱液标本和皮屑标本均为阳性9例（26.47%）,皮屑标本阴性而疱液标本阳性13例（38.23%）,皮屑标本阳性而疱液标本阴性1例（2.94%）。2.5、真菌荧光镜检、真菌培养和真菌PCR三种方法的比较根据上述疱液标本的金标准,确定诊断为真菌感染的患者18例。在疱液标本中,荧光镜检、真菌培养和真菌PCR三种实验室方法诊断真菌感染的kappa值分别为0.881、0.767、0.761。在疱液标本中,荧光镜检的敏感性、特异性和准确度分别为100%、87.50%、94.12%,真菌培养的敏感性、特异性和准确度分别为77.78%、100%、88.24%,真菌PCR的敏感性、特异性和准确度分别为100%、75%、88.24%。根据上述皮屑标本的金标准,确定诊断为真菌感染的患者12例。在皮屑标本中,真菌荧光镜检、真菌培养和真菌PCR三种实验室方法诊断真菌感染的kappa值分别为0.414、0.721、0.866。在皮屑标本中,荧光镜检的敏感性、特异性和准确度分别为100%、50%、67.65%,真菌培养的敏感性、特异性和准确度分别为66.67%、100%、88.24%,真菌PCR的敏感性、特异性和准确度分别为83.33%、100%、94.18%。2.6、疱液和皮屑标本阳性检出率的比较经疱液标本金标准诊断出18例（52.90%）,经皮屑标本金标准诊断出12例（35.3%）,两者标本任意一种为阳性者即诊断为真菌感染,这为皮肤真菌病诊断的金标准。34例患者中共20例（58.8%）最后被诊断为皮肤真菌病。在这些皮肤真菌病患者中,10例（50%）同时由疱液和皮屑诊断,2例（10%）由皮屑而非疱液诊断,8例（40%）由疱液而非皮屑标本诊断。以疱液标本的金标准作为对照标准,疱液标本的敏感性、特异性和准确性分别为90%、100%、94.1%。以皮屑标本为参照标准时,皮屑标本的敏感性、特异性和准确性分别为60%、100%、76.50%。2.7、真菌PCR后测序和培养鉴定的菌种的比较对真菌培养和PCR鉴定的真菌种类进行分析,发现皮肤真菌病最主要病原为毛癣菌。在真菌培养中,疱液中检出2种14例,皮屑检出2种8例;从临床标本中直接提取DNA进行PCR扩增和测序,在疱液中发现真菌7种22例,皮屑检出6种10例。结论本研究表明,疱液标本在诊断皮肤真菌病中具有较好的敏感性和准确性。通过真菌镜检、真菌培养和真菌PCR,疱液标本能够诊断皮肤真菌病。皮肤真菌病且有水疱、脓疱的患者,可通过收集水疱液标本进行真菌学检查,其中真菌荧光镜检准确度最高,而真菌培养和真菌PCR准确度相等;但如果选用此类患者的皮屑标本进行真菌学检测,会发现真菌PCR准确度最高。这提示我们在诊断有水疱或脓疱的真菌感染皮肤病取材检验时,如果只是确定是否感染,最好选用疱液标本进行真菌荧光镜检快速诊断,但如果需要确定菌种,最好选用皮屑标本进行真菌PCR快速确定菌种。收集疱液可以弥补仅收集皮屑标本进行真菌学检验诊断皮肤真菌病的不足。