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目的:探讨卡介苗对哮喘大鼠气道炎症及重塑的预防作用及可能机制,以α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、白介素-4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)为指标,用IFN-γ/IL-4间接反映Th1/Th2水平,反应炎症指标,CyclinD1、α-SMA反映重塑指标,观察卡介苗是否可以调整Th1/Th2平衡,减轻气道炎症,延缓气道重塑发生,从而改善哮喘症状,控制哮喘发展速度及可能机制。方法:清洁级SD雄性大鼠40只,4周龄,体重50-100克之间,随机分成正常对照组、哮喘模型组、多BCG接种组、BCG干预组每组10只。1正常对照组(NS group):所有的幼鼠于实验第1、8天对幼鼠腹腔注射生理盐水2mL进行致敏,第15天起将幼鼠置于自制的密闭雾化吸入箱内,予生理盐水5mL雾化吸入30min,隔日1次,共激发20次,每次30min。2哮喘模型组(asthma group):所有的幼鼠于实验第1、8天对幼鼠腹腔注射OVA100mg和氢氧化铝100mg (混于9g/L生理盐水2mL中)进行致敏,第15天起将幼鼠置于自制的密闭雾化吸入箱内,予2﹪OVA生理盐水5mL雾化吸入30min,隔日1次,共激发20次,每次30min,以出现烦躁、呛咳、呼吸急促、活动量下降典型的哮喘发作的症状为激发成功。3多BCG接种组(multiple BCG vaccination group) :在OVA致敏前7、3、1天,每只幼鼠分别皮内注射BCG 0.025mg,于实验第1、8天对幼鼠腹腔注射OVA100mg和氢氧化铝100mg (混于9g/L生理盐水2mL中)进行致敏,第15天起将幼鼠置于自制的密闭雾化吸入箱内,予2﹪OVA生理盐水5mL雾化吸入30min,隔日1次,共激发20次,每次30min,以出现烦躁、呛咳、呼吸急促、活动量下降典型的哮喘发作的症状为激发成功。4 BCG干预组(BCG intervention group):所有的幼鼠于实验第1、8天对幼鼠腹腔注射OVA100mg和氢氧化铝100mg (混于9g/L生理盐水2mL中)进行致敏,于激发前7d(第8天)给予皮内注射BCG0.025mg,第15天开始每日激发前30min给予皮内注射BCG,剂量同上。最后一次激发24小时后,1%戊巴比妥钠麻醉动物、取材。动物肺功能检查(检测气道基本阻力和静脉注射乙酰胆碱后气道阻力变化);肺组织行病理切片,HE染色,采用计算机图象分析技术测定支气管基底膜周径(Pbm ),总管壁面积(WAt) ,平滑肌面积(WAm )等反映气道壁厚度的指标;ELISA法检测各组大鼠血清中IFN-γ,IL-4含量的变化;免疫组织化学法检测各组大鼠气道壁CyclinD1、α-SMA的表达变化,并应用图像分析软件测量CyclinD1、α-SMA的相对表达强度。结果:1各组大鼠肺功能的检测:气道激发试验检测呼吸峰值的变化间接反应气道阻力(两者成反比)结果显示:盐水激发(13.02±2.44,10.71±2.47,13.15±1.47,12.43±2.00,F=2.204,P>0.1)和6.25μg/ml乙酰胆碱激发(11.62±0.80,11.16±0.91,11.38±1.03, 10.63±1.19 ,F=1.453,P>0.1)时各组间呼吸峰值的变化无明显差异;随着乙酰胆碱浓度的增加,哮喘模型组(8.79±1.31, 6.47±1.62,4.55±1.03)呼吸峰值较正常组(12.36±1.35 ,12.36±1.59,11.80±1.97)明显减低(F值分别为10.660,25.431,44.125,P<0.01);多BCG组(10.61±0.83,10.70±1.24,0.41±0.93)、干预组(10.47±1.77,9.50±1.04,9.65±1.20)呼吸峰值较正常对照组减低,但减低程度较哮喘模型组低(S-N-K组间分析,P<0.05)。(见Table 1)。2各组大鼠血清IL-4、IFN-γ的检测:哮喘组( 33.98±2.35)ng/L和多BCG组(16.46±1.92)ng/L、干预组(20.89±2.29)ng/L血清IL-4水平比正常组(11.43±2.72 )ng/L显著升高,有显著性差异(F=136.414 ,P<0.01);多BCG组和干预组IL-4水平较哮喘组明显减低,且有统计学差异(S-N-K组间分析,P<0.01),且多BCG组与干预组之间有显著性差异,多BCG组优于干预组(S-N-K组间分析,P<0.01)。(见table.3)。哮喘组(10.9±1.9)ng/L和多BCG组(22.7±2.1)ng/L、干预组(18.5±1.5)ng/L血清IFN-γ水平比正常组(30.4±3.6)ng/L显著减低,有显著性差异(F=90.030,P<0.01);且各组之间均有显著性差异(S-N-K组间分析,P<0.05),多BCG组优于干预组(S-N-K组间分析,P<0.05)。(见table.4)。3肺泡灌洗液细胞计数及分类与正常对照组(5.40±1.52)×10~6细胞总数的表达相比,哮喘模型组( 17.15±3.02 )×10~6、多BCG组(8.78±2.00)×10~6,干预组(11.87±2.31×10~6的数量明显增加,有显著性差异(F=47.930,P<0.01);多BCG组和干预组较哮喘组数量减低,且有统计学意义(S-N-K组间分析,P<0.01),且多BCG组明显优于干预组(S-N-K组间分析,P<0.05)。与正常对照组(0.51±0.18 )×10~6嗜酸性粒细胞的数量相比,哮喘模型组(2.19±0.30)×10~6、多BCG组(1.19±0.31 )×10~6,干预组(1.49±0.30 )×10~6的比例明显增加,有显著性差异(F=62.569,P<0.01);多BCG组和干预组较哮喘组表达减低,且有统计学意义(S-N-K组间分析,P<0.01),且多BCG组明显优于干预组(S-N-K组间分析,P<0.05)。(见table.7)4各组大鼠气道重塑指标的检测:4.1各组大鼠气道管壁厚度的检测哮喘组大鼠肺组织可见明显的炎性细胞浸润,杯状细胞增生,黏液分泌增加和平滑肌细胞增生,卡介苗干预后能明显减少上述改变。分析比较各组大鼠气道管壁面积、平滑肌面积结果显示:哮喘模型组(98.17±9.38、23.36±2.62 )和多BCG(72.10±8.70、13.03±2.62),干预组(80.34±9.23、18.61±2.31)气道管壁面积、平滑肌面积显著大于正常对照( 61.70±8.77、10.61±1.14) (F=23.308;F=51.506;P<0.01),多BCG组和干预组气道管壁面积、平滑肌面积明显小于哮喘模型(S-N-K组间分析,P<0.05)。多BCG组优于干预组(S-N-K组间分析,P<0.05)。(见table.2)4.2各组大鼠气道免疫组化CyclinD1、α-SMA的图像半定量分析,以阳性平均灰度值为统计量(含量与阳性平均灰度值成反比):α-SMA:与正常组(126.3609±6.9006)(见Fig3.A)大鼠气道α-SMA的阳性平均灰度值相比,哮喘组(99.6951±5.8131)(见Fig3.B)、多BCG组(116.6681±9.4061()见Fig3.C)干预组(109.4332±5.0131)(见Fig3.D)的明显减低,有显著性差异(F=15.658,P<0.01);其中哮喘组比多BCG组和干预组表达减低,有显著性差异(S-N-K组间分析,P<0.05)但多BCG组和干预组多BCG组与干预组之间没有显著性差异(S-N-K组间分析,P>0.05)。(见table.5)。CyclinD1:与正常对照组(157.7±4.5079)(见Fig4.A)CyclinD1阳性目标平均灰度的表达相比,哮喘模型组(129.8±4.9666)(见Fig4.B)、多BCG组(152.2±5.0692)(见Fig4.C),干预组(148.3±2.0017)(见Fig4.,D)的阳性平均灰度值明显减低,有显著性差异(F=46.997,P<0.01);多BCG组和干预组较哮喘组表达增加,且有统计学意义(S-N-K组间分析,P<0.01),但多BCG组和干预组多BCG组与干预组之间没有显著性差异(S-N-K组间分析,P>0.05)。(见table.6)。5 CyclinD1与α-SMA及CyclinD1与IFN-γ和IL-4与CyclinD1的相关分析Pearson相关分析证明哮喘模型组大鼠肺组织中CyclinD1与α-SMA的表达成正相关(r=0.728,P=0.000);血清中IFN-γ与肺组织中CyclinD1含量(1/平均阳性灰度值)成负相关(r=-0.529,P=0.008)。血清中IL-4与肺组织中CyclinD1含量(1/平均阳性灰度值)成正相关(r=0.767,P=0.000)。(见table.8,table.9,table.10)。结论:1哮喘模型成功建立,哮喘组大鼠在实验期间出现毛色无光泽、精神萎靡、反应迟钝、体重轻于正常对照组等情况;激发过程中可见大鼠呼吸急促、烦躁不安、张口呼吸、口唇紫绀、甚至四肢瘫软的表现。而正常对照组大鼠在实验过程中无异常表现,饮食、行动、呼吸节律、体重均正常。这为建立哮喘模型组提供依据。2哮喘模型组各大鼠肺组织病理可见大量炎性细胞浸润,肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸性粒细胞比例明显高于正常对照组,血清IL-4水平明显升高,IFN-γ水平下降,IL-4/IFN-γ比例升高,且均与正常对照组有显著性差异,提示Th2反应在哮喘发病中占主要的地位。Th1/Th2比例失衡在哮喘发病中起到重要的作用。3多BCG组和BCG干预组大鼠肺组织病理中的炎性细胞低于哮喘模型组但高于正常对照组,肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸性粒细胞比例低于哮喘模型组但高于正常对照组,血清IL-4水平低于哮喘模型组但高于正常对照组,IFN-γ水平高于哮喘模型组但低于正常对照组,IL-4/IFN-γ比例低于哮喘模型组,说明BCG可以调节Th1/Th2比例平衡,促进Th1型反应,抑制Th2型反应,减轻气道炎症。4哮喘模型组气道α-SMA和cyclinD1含量(1/阳性平均灰度值)水平明显高于正常组且差别有统计学意义,说明哮喘发病初期即有气道重塑发生。行IL-4与cyclinD1(1/阳性平均灰度值)相关分析成正相关,α-SMA与cyclinD1相关分析成正相关,推测Th2分泌IL-4,进而产生各种炎性介质刺激cyclinD1的表达,启动细胞周期,气道平滑肌细胞增殖导致α-SMA表达增多。BCG干预后α-SMA和cyclinD1(1/阳性平均灰度值)水平明显低于哮喘组,行IFN-γ与cyclinD1(1/阳性平均灰度值)相关分析成负相关,推测BCG可能通过上调Th1反应,促进IFN-γ的产生,而IFN-γ可抑制CDK2的活化和cyclinD1的表达,使G1后期pRb不能高磷酸化,转录因子E2F失去转录活性,气道平滑肌细胞G1/S期转化受阻,从而有效地抑制气道平滑肌增值,减少α-SMA的产生。5多次BCG接种组优于BCG干预组,推测BCG可以预防哮喘炎症及气道重塑的发生,但哮喘炎症及重塑一旦发生,就很难逆转。