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[背景]神经病理性疼痛(neuropathic pain, NPP)是由感觉神经系统损伤引起的一种难治的慢性疼痛,其发病机制复杂,且临床治疗效果欠佳,严重影响患者的生活质量。神经病理性痛时,脊髓背角浅层星形胶质细胞激活,其特异性标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic proteins, GFAP)过度表达,且激活后的星形胶质细胞合成并释放白介素-lβ (interleukin-lβ, IL-lβ)。星形胶质细胞释放的IL-1β：(1)与突触前神经元上白介素-1受体(interleukin-1receptor, IL-1R)结合,进而触发致痛性物质如谷氨酸的释放增多；(2)与突触后神经元上IL-1R结合,激活N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)的主要功能亚单位NR1,使其发生磷酸化,NR1亚单位磷酸化的主要位点是896位丝氨酸(serine8961。磷酸化的NR1亚单位会使NMDA受体分子构象发生改变,使得NMDA受体与其配体谷氨酸的反应性增强,突触后神经元上细胞膜的去极化从而更加明显,磷酸化的NR1参与了神经病理性疼痛的产生和维持过程。研究表明,IL-1β突触前和突触后的整体效应是过度放大痛觉信号,促使痛觉过敏。但是,能否通过IL-1β下调NRl的磷酸化来缓解神经病理性疼痛尚不清楚,需要进一步研究。本研究通过构建重组腺病毒介导的IL-1β短发夹RNA (IL-1P short hairpin RNA mediated by recombinant adenovirus, rAd/shRNA-IL-lβ)表达载体,选择性下调脊髓背角胶质细胞IL-1β基因的表达,从而阻断NMDA受体NR1亚单位serine-896的磷酸化(pNRlserine-896),进而观察对大鼠神经病理性疼痛行为学症状、热痛阈和蛋白表达的影响,为神经病理性疼痛的治疗提供新方法。[目的](1)复制大鼠神经病理性疼痛模型：慢性压迫背根神经节(chronic compression of dorsal root ganglion, CCD)模型。(2)观察鞘内注入rAd/shRNA-IL-lβ对大鼠神经病理性疼痛行为学症状、热痛阈和蛋白表达的影响。[方法]第一部分实验：复制神经病理性疼痛CCD模型选取健康雄性SD大鼠60只,体重200-250g。随机分为3组(n=20)：CCD模型组、假手术组(Sham组)和正常对照组(Control组)。CCD组在大鼠脊髓L4和L5椎间孔插入4#钢针制备慢性压迫背根神经节神经病理性疼痛模型(chronic compression of dorsal root ganglion, CCD)、Sham组仅用针头探及椎间孔而不插入钢针,Control组不做任何处理。分别在术前1d及术后1w、2w、4w测定大鼠热缩足反应潜伏期(paw withdrawal latency, PWL);测定完PWL值后,在4w时每组随机选取4只大鼠采用灌注法处死,采用免疫组化染色观察损伤侧脊髓背角星形胶质细胞形态学上和数量上的改变,以及GFAP、IL-lβ和pNRlserine-896蛋白表达的改变；在4w时每组随机选取4只大鼠采用断头法处死,Western blot检测损伤侧脊髓背角IL-1β和pNRlserine-896蛋白表达的改变。第二部分实验：观察鞘内注入rAd/shRNA-IL-β对大鼠神经病理性疼痛行为学症状、热痛阈和蛋白表达的影响。选取健康雄性SD大鼠100只,体重200-250g。随机分为5组(n=20)：CCD模型组；过表达腺病毒载体组(rAd/IL-lp组)；空白腺病毒载体+CCD组(rAd+CCD组)；过表达腺病毒载体+shRNA腺病毒载体+CCD组(rAd/IL-lβ+rAd/shRNA-IL-lβ+CCD组)；shRNA腺病毒载体+CCD组(rAd/shRNA-IL-lβ+CCD组)。CCD模型同实验的第一部分；rAd/IL-lβ组是将5ul rAd/IL-lβ鞘内注射到正常大鼠,2w时鞘内追加一次；rAd+CCD组是将5ulrAd鞘内注射到正常大鼠内,1W建立CCD模型,建模后2w鞘内追加一次；rAd/IL-1p+rAd/shRNA-IL-lβ+CCD组是将过5ul rAd/IL-lβ+5ul rAd/shRNA-IL-lβ鞘内注射到正常大鼠内,1w建立CCD模型,建模后2w鞘内追加一次；rAd/shRNA-IL-1p+CCD组是将5ul rAd/shRNA-IL-lβ鞘内注射到正常大鼠内,1w建立CCD模型,建模后2w鞘内追加一次。分别在建CCD模型前1d,建模后1W、2W、4W测定大鼠PWL值,测定完PWL值后,在4w时每组随机选取4只大鼠采用灌注法处死,采用免疫组化染色观察损伤侧脊髓背角星形胶质细胞形态学上和数量上的改变,以及GFAP、IL-lβ和pNRlserine-896蛋白表达的改变；在4w时每组随机选取4只大鼠采用断头法处死,Western blot检测损伤侧脊髓背角IL-1β和pNRlserine-896蛋白表达的改变。[结果]第一部分实验：复制神经病理性疼痛CCD模型1、行为学上的改变：大鼠在术后出现抬足、舔足等保护性的行为。2、PWL值的改变：①与Control组比较,CCD组的PWL值在术后的各时点明显降低(P<0.05); Sham组术后1W时PWL值显著降低(P<0.05),其余各时点的PWL值差异无统计学意义(P>0.05)。②与术前1d比较,CCD组术后各时点的PWL值明显降低,2w时降至最低,持续至4w (P<0.05); Sham组术后1W时的PWL值显著降低(P<0.05),其余各时点的PWL值差异无统计学意义(P>0.05); Control组各时间点的PWL值差异均无统计学意义(P>0.05)。3、免疫组化结果：与Control组比较,GFAP免疫组化染色显示,CCD组4w时损伤侧激活的星形胶质细胞发生肥大、增生和突起增多(P<0.05),损伤侧脊髓背角IL-1β及pNRlS896的表达上调(P<0.05)。Sham组差异无统计学意义(P>0.05)。4、Western Blot结果：与Control组相比,CCD组4w时损伤侧脊髓背角细胞因子IL-1β和pNRlserine-896的表达上调(P<0.05); Sham组差异无统计学意义(P>0.05)。第二部分实验：观察鞘内注入rAd/shRNA-IL-lβ对大鼠神经病理性疼痛行为学症状、热痛阈和蛋白表达的影响。1、行为学上的改变：CCD模型组、rAd/IL-lβ组、rAd+CCD组和rAd/IL-lβ+rAd/shRNA-IL-lβ+CCD组大鼠在术后出现抬足、舔足等保护性的行为,rAd/shRNA-IL-1β+CCD组大鼠在术后无抬足、舔足等保护性的行为行为。2、PWL值的改变：①与CCD模型组相应各时间点相比,rAd/IL-lβ组、rAd+CCD组和rAd/IL-1β+rAd/shRNA-IL-1β+CCD组各时点的PWL值差异无统计学意义(P>0.05); rAd/shRNA-IL-1β+CCD组术后1W、2W、4w时的PWL值明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。②与建模前1d相比,CCD模型组、rAd/IL-1β组、rAd+CCD组和]Ad/IL-1β+rAd/shRNA-IL-1β+CCD组术后各时点的PWL值明显降低,2w时降至最低,持续至4w (P<0.05); rAd/shRNA-IL-1β+CCD组术后1W、2W、4W的PWL值差异均无统计学意义(P>0.05)。3、免疫组化结果：①与CCD模型组相比,4w时rAd/IL-1β组、rAd+CCD组和rAd/IL-1β+rAd/shRNA-IL-1β+CCD组GFAP、IL-1β和pNR1、serine-896的改变差异均无统计学意义(P>0.05)；4w时rAd/shRNA-IL-1β+CCD组,GFAP免疫组化染色显示,损伤侧激活的星形胶质细胞逆转,不再是肥大、增生和突起增多,差异有统计学意义(P<0.05),IL-1β和pNR1serine-896均下调,差异有统计学意义(P<0.05)。②与rAd/shRNA-IL-1β+CCD组相比,4w时CCD模型组、rAd/IL-1β组、rAd+CCD组和rAd/IL-1β+rAd/shRNA-IL-1β+CCD组GFAP免疫组化染色显示,损伤侧激活的星形胶质细胞均肥大、增生和突起增多,差异有统计学意义(P<0.05),IL-1β和pNR1serine-896均上调,差异有统计学意义(P<0.05)。4、Western Blot结果：①与CCD模型组相比,4w时rAd/IL-1β组、rAd+CCD组和rAd/IL-1β+rAd/shRNA-IL-1β+CCD组脊髓背角IL-1β和pNR1serine-896的表达不下调,差异无统计学意义(P>0.05)；4w时rAd/shRNA-IL-1β+CCD组ⅠL-1β和pNR1serine-896的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05)。②与rAd/shRNA-IL-1β+CCD组相比,4w时CCD模型组、rAd/IL-1β组、rAd+CCD组和rAd/IL-1β+rAd/shRNA-IL-1β+CCD组脊髓背角IL-1β和pNR1serine-896的表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论](1)成功复制了神经病理性疼痛CCD模型：CCD模型组大鼠PWL明显降低,对GFAP免疫组化染色观察显示损伤侧脊髓背角星形胶质细胞肥大、增生和突起增多,GFAP、IL-1β及pNR1serine-896的表达上调,表明CCD模型制备成功。(2)观察鞘内注入rAd/shRNA-IL-lβ对大鼠神经病理性疼痛行为学症状、热痛阈和蛋白表达的影响：给CCD模型组大鼠鞘内注入rAd/shRNA-IL-lβ后,可以逆转PWL值降低,星形胶质细胞形态学的改变上也发生逆转,GFAP、IL-lβ和pNRlserine-896的高表达受到抑制,表明shRNA起到了作用。以上结果显示,神经病理性疼痛CCD模型大鼠鞘内注射rAd/shRNA-IL-lβ表达载体后,显著下调星形胶质细胞IL-1β的表达水平,可能参与了pNRlserine-896表达下调,从而有效减轻了大鼠神经病理性疼痛症状。