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目的:探讨不同浓度NaAsO2对L-02肝细胞凋亡的影响,研究JNK信号通路在NaAsO2诱导L-02肝细胞凋亡中的作用,为探索JNK信号通路在砷致肝损伤的机制研究中的作用提供一定实验依据。 方法:实验分为空白对照组、SP600125对照组、染毒组和抑制剂组。SP600125对照组和抑制剂组实验前用 JNK特异性抑制剂(SP600125)处理 L-02肝细胞30min,再同正常对照组和染毒组一起用不同浓度NaAsO2处理L-02肝细胞24h,采用MTT法检测L-02肝细胞存活率;流式细胞术检测L-02肝细胞细胞凋亡率;RT-PCR技术检测 L-02肝细胞中 Jnk、Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3基因mRNA相对表达;Western-blot技术检测L-02肝细胞中Jnk、p-Jnk、Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3蛋白的相对表达。 结果:1.NaAsO2对L-02肝细胞生长和凋亡的影响:与正常对照组相比,各染毒组的细胞存活率随 NaAsO2浓度的增加而降低,差异有统计学意义(p<0.05);各染毒组的细胞凋亡率随NaAsO2浓度的增加而升高,差异有统计学意义(p<0.05)。 2.NaAsO2对L-02肝细胞内Jnk表达水平的影响:RT-PCR显示:与正常对照组相比,各染毒组的细胞内 Jnk mRNA相对表达量 NaAsO2浓度的增加而增高,100μmol/L、150μmol/L增高明显,差异有统计学意义(p<0.05);Western-blot显示:与正常对照组相比,各染毒组的细胞内 Jnk、p-Jnk蛋白表达量均高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。 3.NaAsO2对L-02肝细胞内Bax、Bcl-2表达水平的影响:RT-PCR和Western-blot均显示:与空白对照组相比,各染毒组的细胞内 Bax、Bcl-2表达量均增高,差异有统计学意义(p<0.05);各染毒组的Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量的比值有随剂量的增加而升高的趋势,100μmol/L组低于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05);各NaAsO2组的Bax/Bcl-2蛋白表达量的比值均高于正常对照组,差异有统计学意义(p<0.05)。 4.NaAsO2对 L-02肝细胞内 Caspase-9、Caspase-3表达水平的影响:RT-PCR和Western-blot均显示:与空白对照组相比,各染毒组的细胞内 Caspase-9和Caspase-3表达量均增高,100μmol/L、150μmol/L组差异均有统计学意义(p<0.05)。 5.SP600125对NaAsO2作用L-02肝细胞的影响:SP600125可降低NaAsO2对L-02肝细胞的生长抑制作用,150μmol/L抑制剂组细胞存活率较染毒组增高,差异有统计学意义(p<0.05);50μmol/L、150μmol/L抑制剂组细胞凋亡率较染毒组降低,差异有统计学意义(p<0.05)。RT-PCR显示:各抑制剂组细胞内Jnk、Bax、Caspase-9 mRNA相对表达量较染毒组表达降低,差异有统计学意义(p<0.05);各抑制剂组细胞内 Bcl-2 mRNA相对表达量增高,差异有统计学意义(p<0.05);各 NaAsO2组的Bax/Bcl-2 mRNA相对表达量的比值较染毒组降低,差异有统计学意义(p<0.05);各抑制剂组细胞内Caspase-3 mRNA相对表达量较染毒组表达降低,100μmol/L、150μmol/L降低明显,差异有统计学意(p<0.05);Western-blot显示:50μmol/L、100μmol/L抑制剂组细胞内Jnk较染毒组表达降低,差异有统计学意义(p<0.05)。各抑制剂组细胞内p-Jnk蛋白表达量较染毒组表达降低,除150μmol/L组外差异均有统计学意义(p<0.05);各抑制剂组细胞内Bax、Caspase-9蛋白表达量较染毒组差异明显,差异有统计学意义(p<0.05);50μmol/L抑制剂组细胞内Bcl-2蛋白表达量较染毒组降低,差异有统计学意义(p<0.05)。100μmol/L抑制剂组细胞内Bax/Bcl-2蛋白表达量的比值高于染毒组,其余各组均低于染毒组,差异有统计学意义(p<0.05);150μmol/L抑制剂组细胞内Caspase-3蛋白表达量高于染毒组,其余各组均低于染毒组,差异有统计学意义(p<0.05)。 结论:1. NaAsO2能抑制L-02肝细胞的生长、诱导细胞凋亡的发生;NaAsO2诱导L-02肝细胞凋亡的机制可能与激活JNK,增加p-JNK蛋白表达水平,继而改变Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3等相关基因及蛋白的表达水平有关。 2. NaAsO2诱导L-02肝细胞凋亡的作用可被SP600125阻断,但SP600125并不能完全阻断细胞凋亡的发生,可能与 MAPK信号通路的其他亚型参与了细胞凋亡的发生有关。