背景:慢性心力衰竭(chronic heart failure,CHF)是因为心肌损伤(或病变)和心室长期压力或容量负荷过重,引起心肌收缩力受损,从而导致心室充盈(或)射血能力受损而引起的一组综合征。心肌发生损伤后,交感神经系统和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(rennin angiotensin aldosterone system,RAAS)兴奋,使多种内源性的神经内分泌因子激活,促进心肌重构的发生,这进一步加重了心肌损伤并使心功能恶化,从而形成了恶性循环。尽管近年来对心力衰竭(heart failure,HF)发病机制和临床防治的研究取得了较大进展,但HF导致的死亡人数仍然逐年升高,成为严重威胁人类健康的公共卫生和社会问题。因此,对HF的研究亟待寻求新的突破,为推动HF的防治提供新的思路和理论基础。钠尿肽(natriuretic peptides,NPs)家族的发现开创了心脏内分泌学的新领域,其在心血管系统中发挥着重要的生理及病理生理学调节作用。随着研究的不断深入,学者们发现NPs不仅具有利钠、利尿和舒血管作用,还具有抑制增殖、促进凋亡、免疫调节等广泛的生理和药理学效应。如今NPs已成为HF临床诊断、预后和治疗的明星分子。特别是针对NPs进行不同改构而获得的新型钠尿肽类药物如心活素等已被临床应用于HF的治疗,取得了满意的效果。NPs分子是由羧基端、环状结构和氨基端三部分组成的多肽结构。研究发现,心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)的羧基端的5个氨基酸残基在利尿方面起到重要作用,而环状结构可能与受体结合及产生舒血管等作用有关。因此我们把ANP的羧基端进行了保留,同时与天然NPs分子ANP、脑钠尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)和C-型钠尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)的环状结构和氨基端进行不同的组合,设计出所有可能结构组合的7种新型NPs嵌合体,通过与ANP、CNP和VNP的舒血管活性进行比较,初步筛选出活性相对较强的4种NPs嵌合体:ANCAC、BNAAC、BNBAC、CNAAC。进一步通过对4种NPs嵌合体分子的舒血管效应进行对比,筛选出活性最强的分子为CNAAC并将其用于后续实验以观察其在抗HF中的作用,具体研究内容为:以ANP、CNP和VNP作为对照,1.应用离体血管环灌流实验,研究CNAAC对大鼠腹主动脉的舒张作用及可能机制;2.采用整体动物实验,观察CNAAC对大鼠血流动力学、尿量、尿c GMP及血c GMP水平等指标的影响;3.建立大鼠慢性缺血性HF模型,观察CNAAC对HF大鼠的心脏结构和功能、相关体液因子和蛋白表达的影响。本研究旨在阐明新型NPs嵌合体分子在抗HF中的作用,为临床应用新型NPs嵌合体分子预防和治疗HF提供理论和实验依据。目的:研究4种新型NPs嵌合体的舒血管作用,并筛选出活性最强的NPs嵌合体分子;探讨活性最强的NPs嵌合体的舒血管作用的可能机制;整体动物研究其利尿和降压作用以及在抗HF中的作用。方法:1.采用离体血管环灌流技术,对7种NPs嵌合体进行初步筛选;观察筛选出的4种NPs嵌合体分子对大鼠离体腹主动脉血管环的舒张作用,筛选出活性最强的NPs嵌合体。2.采用离体血管环灌流技术,检测抗NPR-A抗体ab14356、非特异性鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,GC)抑制剂镁蓝(methylene blue,MB)、可溶性鸟苷酸环化酶(soluble guanylyl cyclase,s GC)抑制剂ODQ、c GMP依赖性蛋白激酶(c GMP-dependent protein kinase,PKG)的抑制剂KT 5823、NO合酶(nitric oxide sythase)抑制剂L-NAME(NG-Nitro-L-arginine methyl ester,hydrochloride)、ATP敏感性钾离子通道(ATP-sensitive potassium channel,KATP)阻断剂格列苯脲(glybenclamide,Gly)、钙依赖性钾离子通道(Ca2+dependent potassium channel,KCa)阻断剂四乙胺(tetraethylammonium chloride,TEA)对CNAAC舒血管作用的影响。3.测定给予ANP、CNP、VNP或CNAAC孵育后,离体腹主动脉在不同时间点分泌c GMP的水平,以探讨NPs舒张血管作用与GC/c GMP信号通路的关系。4.大鼠颈静脉注射ANP、CNP、VNP或CNAAC(50μg/kg)后记录血流动力学指标,收集尿液和血液,检测尿量及尿c GMP和血c GMP的水平。5.采用三种不同的HF造模方法:腹主动脉狭窄法、冠脉结扎法以及(腹主动脉狭窄+冠脉结扎)法,并通过观察不同造模组大鼠的一般机体指标、心脏/体重比(heart weight/body weight ratio,HW/BW)、血流动力学、超声心动图和病理学切片等指标,以选取效果最好的方法进行HF造模实验。6.HF造模当天开始腹腔注射ANP、CNP、VNP或CNAAC(20 nmol/kg/2d),持续注射4周后进行一般体征指标观察,对心脏、肺脏进行称重,记录超声心动图和血流动力学指标,观察NPs对HF大鼠心脏功能的影响。7.采用离体血管环灌流技术,检测CNAAC对HF大鼠离体腹主动脉的舒张作用。8.苏木素-伊红(hematoxylin eosine,HE)染色法和Masson染色法(Masson’s trichrome stain)观察心肌损伤和测定ANP、CNP、VNP和CNAAC对大鼠心肌梗死面积(infarct size,IS)和心肌胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)的影响。9.Elisa试剂盒检测各组大鼠血清中BNP、Ang II、ALD、ET-1、c GMP、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10及TNF-α水平的变化。10.Western blotting检测各组大鼠左心室钠尿肽受体A(natriuretic peptide receptor A,NPR-A)和钠尿肽受体C(natriuretic peptide receptor C,NPR-C)的表达情况。结果:1.经过初步筛选,从7种NPs嵌合体分子中得到了4种活性相对较强的NPs嵌合体:ANCAC、BNAAC、BNBAC和CNAAC,这4种嵌合体均可以剂量依赖性的舒张大鼠的腹主动脉,其舒张效应由强至弱依次为:CNAAC>BNAAC>ANCAC>BNBAC;我们将CNAAC与ANP、CNP及VNP的舒血管作用进行了比较,发现CNAAC具有优于其他三种NPs的舒张效应,舒张效应由强至弱依次为CNAAC>VNP≥ANP>CNP,因此我们选取CNAAC作为研究对象进行后续研究。2.CNAAC可以剂量依赖性的舒张大鼠的离体腹主动脉;CNAAC的舒张作用可被NPR-A抗体ab14356(1:1000)、GC的抑制剂MB(10-5 M)、s GC的抑制剂ODQ(10-5M)、KATP的阻断剂Gly(10-6 M)、KCa的阻断剂TEA(10-3 M)显著减弱,被PKG抑制剂KT5823(10-5M)完全阻断;而NO合酶抑制剂L-NAME(10-4M)对CNAAC引起的舒张作用没有显著影响,在去内皮组和保留内皮组其舒张作用没有明显差异。3.在不同的时间点,10-6 M的NPs均可以引起血管释放c GMP。CNAAC在孵育血管5 min、15 min及30 min时引起的c GMP释放量均明显高于ANP、CNP或VNP,且CNAAC引起的c GMP释放具有时间依赖性。提前给予ODQ处理后,CNAAC引起的c GMP释放量明显减少。4.静脉注射ANP、VNP和CNAAC后,大鼠尿量均明显增加,但静脉注射CNP后,尿量未见明显增加,利尿作用由强至弱为:CNAAC>ANP≥VNP>CNP;静脉注射ANP、CNP、VNP和CNAAC后,大鼠的平均动脉压均明显降低,其尿c GMP和血浆c GMP水平均明显增加。5.整体实验中,选用缺血性HF模型,各给药组在大鼠冠脉结扎当天开始给予腹腔注射ANP、CNP、VNP或CNAAC(20nmol/kg/2d,4 weeks)。CNAAC仍然可以剂量依赖性的舒张HF大鼠的离体腹主动脉,且与内皮无关。6.与对照组相比,HF组大鼠精神萎靡,毛色暗黄,活动度、饮食饮水减少,HW/BW、肺脏/体重比(pulmonary weight/body weight ratio,PW/BW)增高;与HF组相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可改善大鼠的一般体征指标、明显降低大鼠的HW/BW,仅VNP和CNAAC可显著降低大鼠的PW/BW;血流动力学指标检测显示:与对照组相比,HF组大鼠LVSP和±dp/dtmax明显下降、LVEDP明显上升;与HF组相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明显改善大鼠的LVSP、LVEDP和±dp/dtmax;超声心动图检测显示:与对照组相比,HF组大鼠左室前壁搏动幅度变弱,室腔扩大;与HF组相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明显改善大鼠的EF、FS、LVEDV和LVESV,但只有CNAAC可明显改善大鼠的LVEDD和LVESD,且CNAAC对LVEDD、LVESD、LVEDV和LVESV的改善作用明显优于ANP、CNP或VNP。7.HE染色显示:对照组心肌排列整齐,心肌横纹清楚,未见明显心肌梗死;HF组和各给药组呈现显著的心肌梗死,出现炎性细胞浸润,梗死区纤维化严重。Masson染色显示:对照组心室腔、室间隔正常;HF组和各给药组左室壁变薄、苍白,室间隔增厚,出现大量蓝色胶原纤维。与HF组相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明显减少心肌IS和CVF;其中CNAAC和VNP对IS的改善作用明显优于ANP和CNP,而且CNAAC对CVF的改善作用明显优于其他各组。8.与对照组相比,HF组大鼠血清中BNP、Ang II、ALD和ET-1的水平均明显增高;与HF组相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明显降低大鼠血清中Ang II和ET-1的水平;但仅有VNP和CNAAC可明显降低大鼠血清中的BNP水平,仅有ANP、VNP和CNAAC可显著降低大鼠血清中ALD的水平。与对照组相比,HF组大鼠血清中c GMP的水平明显降低,ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明显增高大鼠血清中c GMP的水平。9.与对照组相比,HF组大鼠血清中炎症因子IL-1α、IL-6、IL-8和TNF-α的水平均明显升高;与HF组相比,ANP、CNP和CNAAC可明显降低大鼠血清IL-1α的水平;ANP、CNP、VNP和CNAAC均可明显降低大鼠血清IL-6的水平;仅CNAAC可明显降低大鼠血清IL-8和TNF-α的水平,CNAAC对大鼠血清IL-8和TNF-α的水平的降低作用优于其他三种NPs;血清IL-10水平在各组之间没有显著性变化。10.与对照组相比,HF组大鼠心脏的NPR-A表达量明显减少;与HF组相比,ANP、VNP和CNAAC可明显增加NPR-A的表达量,相互间没有明显差异,但CNP对NPR-A表达量的影响远低于ANP。与对照组相比,HF组大鼠心脏的NPR-C表达量明显增加;与HF组相比,ANP、CNP、VNP和CNAAC均明显降低NPR-C的表达量。相互间没有明显差异。结论:1.本研究将ANP羧基端与不同天然NPs的环状结构和氨基端进行组合,设计并合成了具有生物活性的7种NPs嵌合体分子,经过筛选获得了ANCAC、BNAAC、BNBAC和CNAAC等4种NPs嵌合体分子均具有剂量依赖性的舒张血管作用,其舒张效应由强至弱依次为:CNAAC>BNAAC>ANCAC>BNBAC;其中CNAAC可以剂量依赖性、非内皮依赖的舒张大鼠的腹主动脉,其舒张作用可能与NPR-A/s GC/PKG通路有关,KATP和KCa可能是CNAAC舒张作用的重要效应分子。2.静脉注射CNAAC具有显著的利尿和降压作用,c GMP可能参与了其上述过程。3.腹腔注射CNAAC可以显著改善HF大鼠的左室收缩和舒张功能,减轻HF时心肌肥厚、肺淤血程度以及心肌梗死和心肌纤维化的发生,并抑制多种体液因子和炎症因子水平的异常升高,增加NPR-A的表达,减少NPR-C的表达。总之,CNAAC具有显著的改善心脏功能、利尿、舒张血管等效应,提示其可能将在CHF的预防和治疗中有良好的应用前景。