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研究背景:随着国内社会人口老龄化的程度持续加深,骨质疏松症(osteoporosis,OP)已成为严重威胁中老年人群健康的慢性病之一。老年OP是由多种原因导致骨量下降、骨微结构破坏,造成骨脆性增加,易发生骨折的一种全身性骨病。已严重影响到患者的正常生活。已有大量研究结果显示中药及其有效成分可诱导骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells,BMSCs)分化为成骨细胞(Osteoblast,OB)。OB是调节骨的形成及重建的主要功能细胞,通过激发OB的增殖可以促进骨量的增加以用于治疗OP。研究目的:通过探究三七总皂苷(Panax Notoginseng Saponins,PNS)对体外培养大鼠BMSCs向成骨细胞增殖、分化的影响及其机制,来探索PNS在应用于临床疾病的最佳条件,为老年骨质疏松症的防治提供科学依据。研究方法:1.BMSCs体外培养、传代及成骨分化能力鉴定研究:复苏冻存的原代大鼠BMSCs(P0)采用全骨髓贴壁法进行传代培养,取传代至第三代(P3)的细胞进行后续实验,镜下观察BMSCs的形态学特点。用成骨诱导液培养BMSCs 21d后,采用茜素红染色法检测细胞内钙结节的形成情况,以鉴定大鼠BMSCs成骨分化的能力。2.PNS诱导BMSCs向成骨细胞增殖分化的影响研究.:取P3代大鼠BMSCs分别用不同的培养液进行培养,对照组低糖DEME培养液组,实验组1成骨诱导液组(阳性对照组),实验组2-4于成骨诱导培养液内分别加入浓度梯度为10mg/L、50 mg/L、100 mg/L的PNS培养液组。而后分别于3d、7d、9d采用茜素红染色法检测各组细胞内钙结节的形成,MTT法检测各组BMSCs增殖情况。于14d采用RT-PCR法检测各组细胞内碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、核心结合因子 al(Core-binding factor al,Cbfal)、骨钙蛋白(Osteocalcin,OCN)的相应mRNA表达。3.PNS诱导BMSCs向成骨细胞增殖分化的机制研究:取P3代大鼠BMSCs分别用不同培养液进行培养,对照组成骨诱导液组,实验组1在成骨诱导液中加入最适浓度(由上述实验所得结果)100mg/LPNS培养液,实验组2在实验组1的基础上加入特异性ERK1/2信号通路抑制剂U0126 10umol/L,培养21d后采用茜素红染色法检测各组细胞阳性钙结节的形成,14d采用RT-PCR法检测各组细胞内成骨相关因子ALP、Cbfal、OCN的相应mRNA表达。研究结果:1.大鼠BMSCs原代细胞种瓶以后,6h可见少数细胞贴壁,并成团聚集,第5-7天可见细胞集落扩大,细胞融合达80%以上,即进行传代,传代后细胞生长逐渐均匀,传至第三代,镜下可见BMSCs细胞贴壁生长,形态基本一致,呈梭形。在成骨诱导液培养下,P3代BMSCs可成功向成骨细胞分化,21d后茜素红染色可见大量阳性钙结节红染。2.在不同浓度PNS骨诱导液培养下,PNS在一定浓度范围内促进BMSCs的增殖、钙结节的形成与其浓度呈正相关,其中以浓度为100mg/LPNS作用最为显著(P<0.05)。RT-PCR检测结果:100mg/LPNS骨诱导液组其细胞内ALP、Cbfa1、OCN的相应mRNA表达最高(P<0.05)。3.在各组不同培养液的培养下,100PNS骨诱导液组茜素红染色阳性钙结节量高于单纯骨诱导组及U0126抑制剂组(P<0.05),100PNS骨诱导组与其它两组比较均有明显差异(P<0.05),而U0126抑制剂组低于100PNS骨诱导组(P<0.05)。RT-PCR检测结果显示100PNS骨诱导组细胞内ALP、Cbfa1、OCN的mRNA表达量最高(P<0.05),U0126抑制剂组低于100PNS骨诱导组(P<0.05)。研究结论:1.三七总皂苷促进BMSCs的增殖及成骨分化在一定范围内与其浓度呈正相关,其中以浓度为100mg/L PNS作用最为显著。2.三七总皂苷促进BMSCs向成骨细胞定向分化的机制可能是通过ERK1/2信号通路起作用。