【摘 要】
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杏（Prunus armeniaca L.）是重要的蔷薇科（Rosaceae）核果类果树。其果实在成熟过程中逐渐软化、色泽加深、香味变浓,并积累类胡萝卜素等营养物质,属于典型的呼吸跃变型果实,是研究果实成熟的理想材料。脱落酸（ABA）是调控果实成熟的重要激素,其受体基因PYLs是ABA信号通路的核心元件。PYLs调控草莓等非呼吸跃变型果实成熟的作用已有报道,但PYLs是否介导ABA调控呼吸跃变型果
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杏（Prunus armeniaca L.）是重要的蔷薇科（Rosaceae）核果类果树。其果实在成熟过程中逐渐软化、色泽加深、香味变浓,并积累类胡萝卜素等营养物质,属于典型的呼吸跃变型果实,是研究果实成熟的理想材料。脱落酸（ABA）是调控果实成熟的重要激素,其受体基因PYLs是ABA信号通路的核心元件。PYLs调控草莓等非呼吸跃变型果实成熟的作用已有报道,但PYLs是否介导ABA调控呼吸跃变型果实成熟及其分子机制尚不清楚。本研究以‘旦杏’果实为材料,通过外源ABA处理,揭示了ABA对杏果实成熟的调控作用。基于前期基因共表达网络分析（WGCNA）从杏果实转录组数据中挖掘ABA受体基因及生物合成与信号转导相关基因,并分析候选基因在果实成熟过程中对外源ABA的响应。克隆筛选到PYLs基因全长,利用系统进化树和蛋白质结构域分析进行功能预测,对其中一个重要候选基因Pa PYL9进行转基因番茄功能验证,通过转录组测序分析筛选了参与Pa PYL9调控果实成熟相关的基因,并初步构建其调控网络,为后续深入解析PYLs家族成员调控果实成熟的分子机制奠定基础。主要研究结果如下:1、转色前‘旦杏’经ABA处理后,果实的色差指数（Color index of grape,CIRG）显著上升,硬度显著下降,还伴随着果实可溶性固形物（Total soluble solids,TSS）含量显著上升（p<0.01）和可滴定酸（Titratable acid,TA）含量迅速下降。2、基于基因共表达网络分析（WGCNA）,从杏转录组数据中共筛选出12个可能参与ABA调控杏果实成熟的候选基因。包括6个ABA受体基因（PYL9/RCAR1,U22307;PYL8/RCAR3,U13924;PYL4.1/RCAR10,U18739;PYL4.2/RCAR10,U22578;PYL1/RCAR12,U23298;PYL2/RCAR14,U16157）,1个NCED1（U19863）基因,3个PP2Cs（PP2C11,U4803;PP2C33,CL539.2;PP2C27,U19425）基因,1个Sn RK2（U3561）基因和1个ABF2（U6847）基因。3、通过q RT-PCR技术,分析了杏果实成熟过程中ABA生物合成和信号通路相关候选基因对外源ABA的响应。结果表明,经ABA处理后,Pa NCED1、Pa PYL4.1/8/9、Pa PP2C11、Pa Sn RK2和Pa ABF2的表达量显著上调（p<0.05）,Pa PYL1/4.2和Pa PP2C33表达量上调,但无显著性差异。Pa PYL2和Pa PP2C27表达量下调,也无显著性差异（p≥0.05）。4、利用RACE技术克隆得到Pa PYL1、Pa PYL2、Pa PYL4.1、Pa PYL4.2、Pa PYL8、Pa PYL9基因全长,含有完整开放阅读框的基因序列分别为636 bp、600 bp、660 bp、648 bp、576 bp、552 bp,各自编码183、191、219、215、211和199个氨基酸。系统发育分析表明,Pa PYL8和Pa PYL9聚类在第Ⅰ亚家族,Pa PYL4.1和Pa PYL4.2属于第Ⅱ亚家族,Pa PYL1和Pa PYL2属于第Ⅲ亚家族。蛋白质结构域分析表明,6个PYLs基因都含有和其他蛋白作用的PYL＿PYR＿RCAR＿like高度保守结构域,并存在四个保守环CL1-CL4。三级结构预测发现,Pa PYL1/4.1/8/9呈单体状态,而Pa PYL2/4.2属于二聚体。5、在Tom番茄中过表达Pa PYL9基因发现,与野生型番茄果实相比,过表达Pa PYL9促进了番茄果实的着色和软化,其中果实的CIRG显著上升,硬度显著下降,TSS含量显著上升,TA的含量显著下降（p<0.01）,表明杏Pa PYL9基因具有促进果实成熟的作用。6、对转基因番茄果实进行转录组分析表明,过表达Pa PYL9显著上调了ABA合成、乙烯合成、NAC等成熟调控因子、色素合成与代谢、果实软化以及风味形成相关基因的表达,证明Pa PYL9可通过其信号转导通路并整合乙烯信号及其他成熟调控因子加速果实成熟。
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