核盘菌[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]是一种重要的植物病原真菌,可侵染油菜、大豆、向日葵和众多蔬菜,严重影响了这些作物的产量和品质。植物和病原菌在长期的进化过程中,形成两层防御系统,第一层是由病原相关分子模式PAMP（Pathogen associated molecular immunity）激发的PTI（PAMP-triggeredimmunty）免疫反应,第二层是病原物分泌的效应子激发的ETI（effector-triggered immunty）免疫反应。本研究前期通过农杆菌介导的瞬时表达技术,发现核盘菌SsXyl2可引起本氏烟叶片的坏死,推测其能激发植物免疫反应。为揭示该蛋白激发植物免疫反应的相关特性和作用机理,以及在核盘菌致病过程中的功能,本研究对核盘菌SsXyl2蛋白进行了深入的研究。生物信息学分析发现SsXyl2编码区共846bp,编码281个氨基酸,保守结构域分析表明SsXyl2含有两个保守结构域,分别是N端的糖基水解酶第11家族（Glycoside Hydrolase,GH11）和C端的纤维素结合域（Cellulose-binding domain,CBD）。氨基酸序列的多重比对分析发现,SsXyl2与Bc Xyn11A、Tr XYN2和SsXyl1蛋白中的编码木聚糖酶的氨基酸序列的相似性较高,分别是63.9%、60.1%和42.9%,系统进化树显示SsXyl2与灰葡萄孢菌中的Bc Xyn11A聚为一个小的分支,说明二者的亲缘关系较近。利用定点突变技术将SsXyl2的116位谷氨酸（E）突变为谷氨酰胺（Q）获得SsXyl2E116Q突变体,通过DNS法测定其木聚糖酶的活性,结果显示与SsXyl2相比,该突变体的木聚糖酶活性几乎全丧失,通过在本氏烟中瞬时表达SsXyl2和SsXyl2E116Q突变体,结果显示二者均可诱导植物细胞死亡,表明SsXyl2诱导植物细胞死亡的活性与木聚糖酶的活性无关。Signal P 5.0预测分析显示SsXyl2蛋白的N端有一个典型的信号肽结构,酵母信号陷阱试验显示携带信号肽序列的重组载体p SUC2-SsXyl2sp的酵母菌株可在YPRRA培养基上生长,而携带p SUC2和YTK12的酵母菌株均不能生长,表明SsXyl2蛋白的信号肽具有分泌功能。PR1 SP-SsXyl220-281突变体可诱导植物细胞死亡,而SsXyl220-281突变体却不能,表明SsXyl2蛋白在质外体具有诱导细胞坏死的活性。进一步研究发现,来自GH11结构域中的124-219aa足以诱导植物细胞死亡。此外,DAB染色显示SsXyl2处理的本氏烟叶片含有大量金黄色沉淀,表明SsXyl2蛋白可诱导活性氧的积累。本研究通过免疫共沉淀和蛋白质的LC-MS/MS分析获得了可能与SsXyl2互作的本氏烟蛋白库,利用酵母双杂交和荧光双分子互补技术筛选了SsXyl2的互作蛋白,结果显示SsXyl2与本氏烟中的Nb HIR1蛋白互作。利用VIGS技术对Nb HIR1基因进行了沉默,结果显示与对照组TRV:GFP相比,处理组TRV:Nb HIR1接种核盘菌后病斑显著下降,表明Nb HIR1基因的沉默不利于核盘菌的入侵。本研究通过实时荧光RT-q PCR分析了SsXyl2基因的表达模式,发现该基因在致病后期的表达量显著升高,表明该基因的表达受寄主植物的诱导。此外,本研究构建了SsXyl2的敲除载体和互补载体,并通过PEG介导的原生质体转化法成功获得了SsXyl2的敲除转化子KO12和互补转化子KOC1,在离体油菜叶片和活体拟南芥叶片上测定各转化子的致病力,结果显示KO12的致病力显著降低,而KOC1的致病力则恢复至野生型水平,表明SsXyl2参与了核盘菌的致病过程。