手足口病是一种病毒性传播疾病，以手、脚、腹股沟和臀部的斑丘疹或水疱为特征，并伴有口腔溃疡性疼痛的儿童易患疾病，主要是由肠道病毒引起，以EV-A71、柯萨奇病毒A16(CV-A16)为主。目前上市的手足口病疫苗仅有EV-A71灭活疫苗，尚未见EV-A71黏膜免疫疫苗以及其它型别肠道病毒疫苗问世。黏膜是病原侵入的重要门户，EV-A71、CV-A16等手足口病患儿的排泄物、口鼻分泌物、唾液及疱疹液等带毒，可通过密切接触、飞沫、污染物品等途径，以口鼻咽部黏膜为入侵门户，会在黏膜及其淋巴组织中复制，复制的较大量的病毒通过吞咽等方式进入肠道，在肠道黏膜及淋巴组织进一步大量增殖，大量复制的病毒通过病毒血症及其它方式扩散至其它器官系统引发相应疾病。因此，口鼻咽的黏膜接种免疫，可以在诱导系统性免疫的同时，可在病毒的入侵门口提供黏膜免疫保障，以提高防护效果。
　　新生儿Fc受体(FcRn)在人体广泛分布，可与Fc在特定条件下发生结合，可保护目的蛋白不被降解，且能够转运Fc融合抗原至黏膜下诱导黏膜免疫应答。我课题组近年来利用重组柯萨奇病毒B3(rCV-B3)减毒株作为递送系统重组表达外源抗原片段能够引起机体的免疫反应。为探索以rCV-B3为病毒载体、以Fc-FcRn为抗原黏膜转运方式、以口鼻咽黏膜接种方式，是否能够诱导机体系统性免疫和有效的黏膜免疫，本课题构建靶向FcRn的EV-A71抗原片段SP70的重组病毒，通过口鼻咽黏膜途径接种小鼠，以期能够有效诱导抗EV-A71中和抗体及黏膜免疫应答。并利用免疫信息学分析EV-A71、CV-A16的有效B细胞、Th细胞及CTL细胞表位，进行基于rCV-B3病毒载体和FcRn转运的多价肠道病毒候选黏膜疫苗分子设计与计算验证。为多价肠道病毒黏膜免疫疫苗的研究提供研究基础。
　　方法：利用生物信息学方法构建SP70-Fc蛋白的三级结构，并模拟该蛋白对机体的免疫系统的激活情况。利用分子生物学方法将SP70-Fc序列插入CV-B3载体中以获得重组病毒质粒。将重组病毒转染vero细胞，并进行传代，利用WB检测蛋白的表达情况，并用电镜观察重组病毒的外部结构。同时通过空斑实验检测病毒增殖情况。将小鼠分为三组，分别为SP70-Fc、SP70-Fc-mut和空白组，三组分别接种105TCID50的F1代病毒以及相同体积的DMEM培养基，通过小鼠眼眶取血以检测血清中和抗体以及EV-A71特异性IgG，以及鼻腔灌洗液中的sIgA情况；在免疫六个月后检测血清中EV-A71特异性IgG情况以及免疫后各器官的病理变化情况。利用生物信息学方法预测EV-A71和CV-A16的抗原表位，通过适当的Linker将表位进行串联，再与Fc片段连接，对构建的多表位蛋白进行理化性质、三级结构以及免疫模拟的预测。
　　结果：对SP70-Fc的预测结果表明能够形成正确的三级结构并能诱导免疫保护。对Fc片段的位点进行了突变，并扩增得到了SP70-Fc序列。成功构建了两株CV-B3-SP70-Fc重组病毒，在转染细胞后能够包装出病毒，在电镜下能够观察到病毒的外部结构。成功表达外源抗原片段，并能成功了获得多代病毒。重组病毒在通过口鼻咽黏膜接种免疫接种小鼠后，能够引起小鼠的免疫反应，在血清中能够检测到针对EV-A71病毒的中和抗体和IgG，以及在鼻腔灌洗液中能够检测到相应的sIgA。在免疫六个月后，在SP70-Fc组的小鼠血清中仍能检测到较高的EV-A71特异性IgG，且各器官均未表现出病理变化。构建的靶向FcRn的多表位串联的针对EV-A71和CV-A16的疫苗蛋白的预测结果显示能够诱导相应的免疫反应。
　　结论：以CV-B3减毒株为载体，重组表达SP70-Fc片段的重组病毒通过口鼻咽黏膜接种免疫后能够成功包装出病毒，表达外源抗原片段，并能够更好的激活机体免疫反应产生有效的黏膜免疫并维持更长时间的特异性IgG而且有良好的安全性；利用CV-B3病毒载体靶向FcRn的重组抗原表达策略可能会成为新的疫苗设计方案。