丹参种质资源鉴定及遗传多样性研究

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鼠尾草属是唇形科中最大的属,全球约有1050种,在热带和温带都有分布,我有78种24变种8变型,各地均有分布,西南地区是最集中也是种类最丰富的地区。本属药用资源丰富,有记载的可作药用的有36种(含变种和变型),其中丹参已被《中华人民共和国药典》收载,是我国传统大宗中药材之一。随着丹参需求量的剧增,药材市场经常会以不同种类的植物来源充当药用丹参销售,严重影响丹参药材的临床应用与研究开发,建立科学可靠、快速简单的鉴定体系显得极为重要。近年来丹参品质退化严重,没有优良的种质就不可能有优良的品种,而了解物种的遗传基础及物种间的亲缘关系是合理有效利用种质资源的基础与前提。因此本研究利用丹参及其近缘野生种资源,从表观形态、显微形态、细胞染色体形态和分子生物学分析等方面开展丹参种质资源的鉴定与亲缘关系探讨,分析种内与种间遗传多样性,揭示其遗传基础丰富程度、各居群的遗传差异和遗传距离,为丹参种质资源的鉴定及合理利用提供依据,为进一步的深入研究和遗传改良奠定良好的基础。主要研究结果如下:(1)通过野外资源的调查与收集,结合标本资料,对四川鼠尾草属植物31个分类群的18个主要生物性状进行比较研究,分析物种表观形态的遗传多样性水平。数量性状研究结果显示叶片部位变异较大,变异程度最大的是叶柄长/叶片长,其次是叶柄长,叶片宽和叶片长,而最小的是花冠长/花萼长。质量形状方面,各生物性状都具有多种类型。主成分分析结果表明叶片宽、花下药室可否育、叶柄长/叶片长和主根是否明显是鼠尾草属植物的特征性状,并在此基础上进行聚类分析,R型聚类结果表明所考察的性状独立遗传,可作为分类的标准;Q型聚类将31个物种分为了4大类,与传统分类学中对该属植物的亚属分类结果基本相符,但柔毛荞麦地鼠尾草的系统地位有待进一步论证。进一步分析了物种间的亲缘关系,为四川鼠尾草属植物的系统分类、亲缘关系鉴定及种质资源利用等提供依据。(2)采用石蜡切片法在光学显微镜下对7个省的丹参及云南鼠尾草、短唇鼠尾草、峨眉鼠尾草、甘西鼠尾草、三叶鼠尾草、黄鼠狼花、血盆草等14份材料的根横切片显微特征进行比较研究。结果显示研究材料在根部显微结构上存在许多共性,如次生皮层均较宽广,韧皮部较狭窄,木质部很发达,形成层一般都比较明显等。但在落皮层、木栓层厚度及木栓化程度、木质部导管多少、孔径大小及排列方式上存在不同程度的差异,这些差异及建立的分类检索表可以为鱼龙混杂的药材市场提供鉴别正品丹参药材的证据,也可以为鼠尾草属植物的鉴定提供依据。(3)通过对不同产地丹参及近缘种植物共12份材料的花粉母细胞减数分裂过程中染色体形态和行为的观察,显示研究的所有物种染色体基数均为x=8,存在二倍体与四倍体两种倍性,除了甘西鼠尾草和短唇鼠尾草为四倍体以外,其余物种均为二倍体。不同物种在染色体构型上存在差异,鼠尾草属物种细胞染色体中,棒状二价体构型比例相对较高,环状二价体比例最高的黄花鼠尾草,表明其交换频率最高,揭示其种内变异程度相对较大,而种内变异最低的为陕西丹参。在河南丹参及短唇鼠尾草中各发现了一条B染色体的存在,异常的细胞分裂行为可能是导致河南丹参出现不育花药的原因之一。(4)从70个RAPD随机引物中筛选出条带清晰、多态性明显、重复好的27个引物进行PCR扩增,鼠尾草属植物扩增后呈现出较为丰富的多态性,平均多态性带为7.67条,多态性比率为83.47%,显示该属物种遗传变异较高。根据不同引物的RAPD指纹图谱中条带的有无计算遗传相似性系数,可以对各样品进行区别。聚类分析显示样品分为四类,所有的丹参材料及其变型白花丹参共8份材料聚为一类,表明遗传多样性主要存在于种间,种内如丹参遗传距离相对较小。RAPD对丹参种质资源材料进行聚类的结果与传统形态学分类结果不完全一致,主要表现在峨眉鼠尾草与黄鼠狼花的系统地位存在分歧。(5)本研究选取四个叶绿体基因或间隔区序列(matK,rbcL, trnL-F和psbA-trnH)以及核基因组ITS区(包括ITS1和ITS2)为候选DNA条形码,探讨不同序列组合在鼠尾草属物种鉴定过程中的有效性,结果显示候选的条形码都达不到动物中COX I基因的理想效果,相对来说单一片段中核基因组ITS1的鉴定率最高,可以达到81.48%,其次为叶绿体trnL-F间隔区序列,鉴定率为77.77%。三种片段组合中,trnL-F+ITS1鉴定率最高,为74.74%,并未超过两个片段单独使用时的鉴定率。在所考察的片段中,ITS1是唯一一个可以将所有丹参样本区分开的序列,我们推荐ITS1作为丹参及鼠尾草属植物的DNA条形码。
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