当前,对肿瘤的治疗手段包括手术、化疗、放疗、免疫治疗、物理治疗等,这些方法的基本思路是把肿瘤看作是一个均质性的整体,以减少肿瘤细胞的数量,最大限度清除肿瘤病灶为目的。但是部分肿瘤细胞对化疗、放疗的抵抗从而造成肿瘤的复发是肿瘤治疗的主要障碍。因此,探索肿瘤发病机制,寻找有效的治疗途径,已成为进一步提高肿瘤病人生存率的关键。 越来越多的证据表明,肿瘤是一种干细胞疾病。研究显示,肿瘤组织中存在极少量的肿瘤干细胞(Tumor Stem Cell,TSC),具有无限增生的潜能,对化疗、放疗具有抗性,在肿瘤中充当干细胞的角色,是肿瘤发生、发展、侵袭、转移、复发及耐药的决定性因素。因此,寻求从肿瘤细胞中分离TSC的有效方法,对丁研究肿瘤的发生发展和转归,肿瘤耐药机制以及肿瘤的靶点治疗研究均有十分重要的意义。 一些研究显示SP细胞(Side population cell)筛选分析是可能用于TSC的鉴定方法之一。SP细胞可以快速将进入细胞核的亲脂的荧光染料排出胞外,在荧光活化细胞分选系统(FACS)检测时表现为不着色或低着色。许多研究者从体外传代肿瘤细胞系中分离出SP亚群,显示SP细胞与TSC有很多共性,如高致瘤性,高表达转运蛋白ABCG2/BCRP,有的表达有相应SC的标记分子如CD34,CD133等。虽然SP细胞只占整个肿瘤细胞群体的很少部分,但是筛选SP细胞群可以富集TSC,因此目前许多学者认为,在缺乏显著的TSC分子标记的情况下,SP细胞的筛选分析可以作为TSC鉴定的一种实用而简易的重要途径之一。 由于对肿瘤的治疗研究,大部分是先在动物肿瘤模型上进行,根据人源性肿瘤细胞与动物源性肿瘤细胞有诸多相似的生物学特性,所以分离与鉴定动物肿瘤TSC对开展TSC的基础和临床研究均有重要意义。为此,我们选择小鼠黑色素瘤细胞B16F10细胞,对其TSC进行了相关的分析研究。 目的： 本研究在前期研究的基础上,先对CD44+CD133+CD24+表型的B16F10细胞异体移植的致瘤性作了研究,再进一步利用FACS技术,从鼠黑色素瘤细胞株B16F10细胞中分选出SP和Non-SP细胞亚群,并在体内外鉴定其生物学特性,分析B16F10细胞中SP细胞是否具有肿瘤干细胞样的特性,以及和化疗药耐药的关系,探索从B16F10细胞株中富集TSC的有效方法,并对TSC耐药机制进行初探。 方法： 1.CD44+CD133+CD24+B16F10细胞异体移植致瘤性研究。经直线加速器高能X射线照射的Balb/c小鼠4小时后,皮下接种3×105CD44+CD133+CD24+B16F10细胞,监测小鼠肿瘤生长情况及生存时间。 2.SP和Non-SP细胞分选。B16F10细胞悬液加入Hoechst3342,然后其中一组加入ABCG2转运蛋白的抑制剂维拉帕米,通过FACS检测B16F10细胞中SP细胞比例,基于FACS分选技术对B16F10细胞中SP和Non-SP细胞分选。 3.SP和Non-SP细胞相关生物学特性研究。对分选的SP和Non-SP细胞分别用细胞计数法连续检测细胞增殖活性,用无血清培养观察其生长特性,用克隆形成试验观察其克隆形成率,按不同数鼍级SP和Non-SP细胞接种C57BL/6小鼠,比较其致瘤性,用MTT法检测对化疗药的耐受性,用流式细胞仪(FCM)检测SP和Non-SP细胞的CD分子表型,综合鉴定SP和Non-SP细胞的相关生物学特性。 4.采用RT-PCR方法半定量分析SP细胞及Non-SP细胞Wnt-2及ABCG2 mRNA的转录水平,并进一步用荧光定量PCR方法检测ABCG2的表达量,对TSC耐药机制进行探讨。 结果： 1.CD44~+CD133~+CD24~+B16F10细胞异体移植致瘤性 经照射的第1组Balb/c小鼠,在接种CD44~+CD133~+CD24~+细胞的第15天,有2只长出肿瘤；其余两只未长出肿瘤,分别在第20、28天死亡。经照射的第2组小鼠,在接种野生型细胞后第15、18、19、25天分别死亡,无肿瘤生长。未经照射的第三、第四组接种CD44~+CD133~+CD24~+B16F10细胞和野生型细胞50天后,未长出肿瘤。 2.B16F10细胞中SP细胞的分选 通过FACS检测结果显示,B16F10细胞系中存在SP细胞,SP细胞的比例为0.96％。 3.B16F10细胞系中SP细胞的生物学特性鉴定 (1)形态学特点 置倒置显微镜下及HE染色观察,发现SP细胞较Non-SP细胞体积小。 (2)细胞增殖实验 SP细胞在普通培养基上生长5天,用细胞计数法连续检测细胞增殖实验结果显示,SP细胞生长活力显著高于Non-SP细胞,差异有显著性意义(p<0.05)。 (3)无血清培养试验 用含表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)20μg/L和碱性成纤维生长因子(Fibroblast Growth Factor-basic,bFGF)20μg/L的无血清1640培养基代替传统含血清培养基,发现SP细胞可在含生长因子的无血清培养基中悬浮存活、增殖,形成自由漂浮的细胞球,细胞球可连续传代,若重新接种于含血清培养基中可重新贴壁分化,贴壁分化后细胞形态与直接在含血清培养基中培养无明显差别,而Non-SP细胞不能无血清培养基中存活。 (4)克隆形成实验 将SP细胞和Non-SP细胞等量接种于平板、软琼脂和96孔板上,结果表明SP细胞的克隆形成率显著高于Non-SP细胞,而且SP细胞形成的克隆大多呈球形,其内的细胞为层叠、集中,Non-SP细胞形成的克隆形态扁平,有些细胞排列松散。 (5)C57BL/6小鼠皮下接种致瘤性试验 将相同数量的SP和Non-SP细胞移植到C57BL/6小鼠皮下,1×10~4个SP细胞即可使8只小鼠中5只鼠成瘤(5/8),而1×10~4个Non-SP细胞接种8只小鼠都没有成瘤(0/8);在3×10~4个SP细胞实验组,7只鼠形成肿瘤(7/8),而该数量的Non-SP细胞只能使(3/8)鼠成瘤。该结果表明SP细胞的致瘤性显著强于Non-SP细胞。 (6)SP细胞和Non-SP细胞对化疗药物长春新碱的耐受性 用MTT法检测SP细胞和Non-SP细胞对化疗药物长春新碱的耐药性。结果显示,在长春新碱0.5μg/ml浓度作用72h对Non-SP细胞细胞的生长抑制明显,对SP细胞的生长抑制不明显,差异有统计学意义(p<0.01)。 (7)SP细胞和Non-SP细胞中CD133~+、CD44~+、CD24~+细胞的比例检测 采用FCM检测SP细胞和Non-SP细胞中CD133+、CD44+、CD24+细胞的比例,结果显示SP细胞中CD44+、CD133+、CD24+细胞表型的比例显著高于Non-SP细胞。 4.TSC耐药机制的初探 对SP细胞的生物学特性研究结果提示,B16F10细胞株中的SP细胞可能是TSC样细胞,对其与耐药有关的分子ABCG2及Wnt-2 mRNA表达情况进行了鉴定。RT-PCR检测发现SP及Non-SP细胞中均存在ABCG2及Wnt-2基因的表达,但SP细胞显著高于Non-SP细胞。进一步用荧光定量PCR检测,结果显示,SP细胞的ABCG2分子表达量是Non-SP细胞的6.27倍。 结论： 1.具有CD44+CD133+CD24+表型的B16F10细胞异体移植到Balb/c小鼠有较强的致瘤性,提示该表型细胞具有TSC样特性。 2.B16F10细胞株中的SP细胞在普通培养基上增殖能力、在体外克隆形成能力、在无血清培养可连续传代能力、在C57BL/6小鼠的高致瘤性及对化疗药物长春新碱具有的耐受性等生物学特性符合TSC的特征。 3.SP细胞中表型CD44+、CD133+、CD24+细胞的比例显著高于Non-SP细胞,表明SP细胞能有效富集TSC,可作为分离鉴定TSC的一种方法。 4.SP细胞能耐受化疗药物长春新碱的机制之一可能与其表面Wnt-2及ABCG2分子表达增高有关。该研究结果为进一步研究TSC及寻找对肿瘤新的治疗靶点提供了可借鉴的方法和资料。