研究背景糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)被认为是一种与糖尿病(diabetes mellitus, DM)相关的心肌结构改变及功能异常,于1972年由Rubler等首次提出。临床上,DCM通常表现为进行性左室肥厚及收缩和舒张功能障碍,其病理特点为心肌细胞肥大、凋亡,微血管病变及间质纤维化等。DCM是一个长期而复杂的病理过程,它可以造成细胞代谢异常,进一步损伤内质网、线粒体、肌原纤维等细胞器,并最终导致心肌细胞肥大和凋亡的增加。而作为一种可调节的、耗能的细胞自杀机制,心肌细胞凋亡数量的增加又进一步加重了DCM过程中的心肌重构与功能障碍。细胞凋亡本质上是一种细胞的程序性死亡,它是指当机体处于生理或病理条件下,细胞启动自身内部机制,经过多途径的信号传导,结束其自身生命的过程。细胞凋亡与细胞增殖相辅相成,共同调节着细胞群体的自我更新,维持机体的协调与平衡,保持内环境的稳态。在DCM的发病过程中,虽然疾病早期即存在着心肌细胞的肥大、增殖和凋亡,但心脏功能尚可维持正常。随着疾病的进一步发展,心肌细胞内环境紊乱,细胞凋亡的程度远远超过了细胞增殖的速度,心肌细胞失去正常的调控,使得凋亡的范围增大,速度加快,组织细胞大量丧失,最终导致心功能严重减退。细胞凋亡的调节机制包括一系列复杂的级联反应,这其中最为重要的就是半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteine aspartic acid specificprotease, caspase)相关的凋亡信号转导通路,包括死亡受体介导的凋亡信号通路,线粒体/细胞色素c介导的凋亡通路和新发现的内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)介导的凋亡通路。内质网(endoplasmic reticulum, ER)是细胞内一种极为重要的细胞器,其主要功能包括脂质合成,蛋白质折叠及钙稳态的调控。真核动物细胞中的大多数分泌蛋白和膜蛋白均需转位至ER腔内进行修饰和折叠。氧化应激、缺血、钙稳态的失衡等诸多因素均可影响ER的功能,导致未折叠或错误折叠蛋白的蓄积,这一过程被称之为ERS。ERS可进一步激活未折叠蛋白反应(unfolding protein response, UPR),早期表现为抑制蛋白质的翻译和转运,促进分子伴侣的表达,诱导内质网相关性降解(ER-associated degradation, ERAD),即将未折叠或错误折叠的蛋白逆转回胞质中,通过蛋白酶进行降解,以减少未折叠或错误折叠蛋白在ER的积聚,维持ER的正常功能。然而,当长期持续的应激或刺激强度超过ER自身处理能力时,UPR便会启动细胞凋亡信号,导致细胞凋亡的发生。而过度的凋亡使得机体细胞大量丧失,最终导致器官功能障碍。因此,ERS如同一把双刃剑,在疾病的初始阶段,它的激活可以促使细胞存活,延缓器官功能的损害；然而随着疾病的进一步发展,若ERS介导的细胞凋亡失去了正常调控,便将导致组织细胞的过度丢失,加速器官功能的衰竭。X盒结合蛋白1(X-box binding protein1, XBP1)是一种新发现的与蛋白折叠及内质网构建相关的蛋白质。它是亮氨酸拉链蛋白家族中重要的转录调控因子,能够与主要组织相容性复合物基因启动子区域的X盒顺式作用元件相结合,是ERS反应的关键信号调控因子。在ERS反应过程中,XBPlmRNA经过需肌醇酶1(inositol-requiring kinase1, IRE1)依赖性的剪接,使得具有261个氨基酸的未剪接型XBP1(X-box binding protein-1unsplicing, XBP1-u)转录激活形成由376个氨基酸构成的剪接型XBP1(X-box binding protein-1splicing, XBP1-s)。 XBP1-s所调控的ERS在疾病初期通常可以促进细胞的生存,然而,随着疾病的进一步发展,ERS长期持续激活最终将导致组织细胞过度凋亡。在DCM的病程中,高血糖、氧化应激、钙稳态失衡等因素均可诱发ERS,进而导致心肌细胞的凋亡。然而,在这一病程中ERS诱导心肌细胞凋亡的机制尚未明确,XBP1在心肌细胞中的表达水平如何,XBP1是否能够通过介导ERS的激活参与心肌细胞的凋亡并发挥关键性的作用,这一系列问题目前国内外尚缺乏相关的研究。缬沙坦是一种选择性AT1受体拮抗剂,在临床上被广泛地应用于降低血压和治疗其他AngⅡ引起的心血管事件。近期研究表明缬沙坦除了具有降压作用之外,还能够通过增加血糖利用,降低链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导的糖尿病大鼠的血糖水平。因此,本研究拟采用缬沙坦干预DCM大鼠,探讨其改善DCM心肌重构的作用,并进一步研究缬沙坦的心肌保护作用与ERS的重要调控因子XBP1之间的联系,旨在为临床上DCM的防治提供全新的治疗靶点和坚实的理论依据。研究目的1.构建糖尿病大鼠模型,验证DCM心肌重构过程中存在ERS介导的心肌细胞凋亡的增加。2.探讨DCM大鼠模型心肌组织中是否存在着XBP1的激活。3.探讨XBP1与DCM大鼠心肌细胞凋亡之间的联系。4.明确缬沙坦逆转心肌重构,尤其是抑制心肌细胞凋亡的作用与XBP1表达水平之间的联系。研究方-法1.DCM动物模型的构建第一阶段：8周龄雄性Wistar大鼠(体重260-280g)50只,以标准大鼠饲料适应性喂养一周。随后,随机分为两组：正常对照组10只,糖尿病组40只。糖尿病组大鼠腹腔注射STZ65mg/kg,正常对照组大鼠腹腔注射同等剂量的柠檬酸盐缓冲液(PH4.5)。 STZ腹腔注射7天后,收集大鼠尾静脉血测空腹血糖,以筛选成模糖尿病大鼠。糖尿病大鼠成模标准：连续2次空腹血糖≥16.7mmol/L (300mg/dl)。未达成模标准者予以剔除。第二阶段：将已达糖尿病成模标准大鼠随机分为2组：DCM组和DCM+缬沙坦组(30mg/kg/d)。正常对照组及DCM组大鼠予以生理盐水灌胃。3组大鼠均再继续喂养16周后处死取材。2.各组大鼠基本指标的监测实验过程中除常规每2周测1次体重和血压,每4周测1次空腹血糖外,分别于STZ注射后7日及实验末抽取空腹尾静脉血测定空腹血糖水平。3.超声心动图检测分别于实验开始时以及实验末对各组进行常规超声心动图检查,主要检测以下指标：心率、左室舒张末期内径(left ventricular internal dimension diastole, LVIDd)、左室收缩末期内径(left ventricular internal dimension systole, LVIDs)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、E波最大速度、A波最大速度、E/A比值、E波减速时间(E deceleration time, EDT)、舒张末期左室后壁厚度(left ventricular posterior wall, LVPW)、舒张末期室间隔厚度(interventricular septum thickness, IVST)、短轴缩短率(fractional shortening,FS)、等容舒张时间(isovolumic relaxation time, IVRT)。4.心肌组织病理学检测实验结束处死动物后,进行取材、固定、脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋、切片,常规H&E染色、Masson三色染色以及天狼星红染色,观察心肌组织结构、细胞形态、胶原分布情况。5. TUNEL染色使用TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒(荧光法)对石蜡切片进行荧光染色,在荧光显微镜下观察,细胞核呈现绿色荧光的心肌细胞即为凋亡细胞,并进行统计分析。6.组织免疫荧光染色取心肌组织石蜡切片,对ERS标志性分子GRP78进行免疫荧光染色以证实ERS的发生7. Western blot检测取-80℃保存的心肌组织,分别提取总蛋白和细胞核蛋白,通过10%-15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)对等量的蛋白样品进行分离、转膜、封闭、一抗孵育、二抗标记、显色等,检测分子伴侣糖调节蛋白(glucose-regulated protein78, GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)、XBP1-s、p53上调凋亡调控因子(p53upregulated modulator of apoptosis, Puma)、cleaved caspase3和cytochrome c的表达。8.半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR检测Trizol法提取心肌组织总RNA,经逆转录获得cDNA,以β-actin为参照,通过半定量RT-PCR技术检测XBP1-s mRNA水平的表达,实时定量RT-PCR技术检测GRP78及CHOP的mRNA表达水平。9.统计学分析所用数据用SPSS17.0统计软件进行分析。数值变量资料数据以均数士标准差表示,两组间均数比较采用小样本t检验,多组间均数比较采用One-Way ANOVA方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.实验动物的基本情况实验第一阶段,糖尿病造模组中3只大鼠未达糖尿病成模标准,予以剔除,剩余37只大鼠达到糖尿病成模标准进入实验下一阶段。正常对照组状态良好。实验第二阶段,5只罹患糖尿病的大鼠死亡,死亡原因可能与感染、糖尿病酮症酸中毒及其他并发症有关。最终共42只大鼠完成实验,其中正常对照组10只,DCM组15只,DCM+缬沙坦组17只。实验过程中,正常对照组(n=10)大鼠精神状态良好,体重明显增加,反应敏捷,毛色白而光泽。DCM组(n=15)大鼠出现多饮、多尿、多食和消瘦(三多一少)症状,体重增加迟缓甚至下降,精神萎靡,皮毛脏乱无光泽。DCM+缬沙坦治疗组(n=17)大鼠一般状态较DCM组相对略好。2.各组大鼠的基本指标监测实验初各组大鼠心率、血糖、体重和血压均无明显差异(P>0.05)。DCM大鼠自成模后多次测血糖,证明血糖水平始终维持在16.7mmol/L以上。实验末DCM组与正常对照组相比,心率和体重随着喂养时间的延长而明显下降,血压则随着喂养时间的延长而升高(P<0.05)；DCM+缬沙坦组大鼠血糖和血压较DCM组有所下降,心率及体重增加(P<0.05)。3.超声心动图检测分别于实验初和实验末通过超声心动图对各组大鼠各项指标进行检测,包括LVIDd、LVIDs、LVEF、E/A比值、FS、EDT’、IVRT’、IVS和LVPW。实验初,实验大鼠各项指标均无显著差异(P>0.05)。实验末,DCM组大鼠较正常对照组LVIDd、LVIDs、IVST、LVPW和IVRT’明显增加(P<0.05),EF、E/A比值下降,FS增加,EDT’增加(P<0.05),证明DCM组大鼠发生了心脏结构及功能异常。DCM+缬沙坦组与DCM组相比,LVIDs、LVIDd、IVST、LVPW和IVRT’有所下降(P<0.05),EF、E/A比值升高,FS下降,EDT’降低(P<0.05),证明缬沙坦治疗能够有效改善心脏功能,抑制心肌重构。4.心肌组织病理学检查H&E染色：正常对照组心肌细胞排列整齐,大小均一,胞浆染色均匀；DCM组与正常对照组相比,心肌细胞肥大,形态不规则,排列紊乱；DCM+缬沙坦组与DCM组相比,细胞肥大减轻,排列较规则。Masson染色：正常对照组心肌胶原纤维排列整齐,心肌小动脉周围少量胶原沉积,心肌间质内少量胶原组织呈散在、长索条状分布；DCM组与正常对照组相比,心肌细胞肥大,排列紊乱,心肌内小血管周围胶原沉积明显增多,粗大胶原纤维交联成网格状；DCM+缬沙坦组与DCM组相比,心肌细胞排列较整齐,心肌间质内和小动脉周围胶原纤维显著减少。天狼星红染色：DCM组与正常对照组相比,Ⅰ型及Ⅲ型胶原显著增加；DCM+缬沙坦组与DCM组相比,胶原纤维含量有所下降。5.DCM组心肌细胞凋亡增加并且缬沙坦能够减少心肌细胞凋亡采用TUNEL染色检测凋亡细胞,并通过Western blot检测凋亡标志性因子Puma、cleaved caspase3和cytochrome c的表达,观察心肌细胞凋亡的水平。结果显示,与正常对照组相比,DCM组大鼠心肌细胞凋亡显著增加(P<0.05)；DCM+缬沙坦组与DCM组相比,心肌细胞凋亡明显减少(P<0.05)。6.DCM大鼠心肌组织中存在ERS的激活并且缬沙坦能够抑制ERS的激活GRP78、CHOP是ERS激活的重要标志分子。通过组织免疫荧光法、Western blot和实时定量RT-PCR检测均显示,正常对照组心肌组织中GRP78、CHOP仅有少量表达,而DCM组心肌GRP78、CHOP表达水平显著上调(P<0.05),DCM+缬沙坦组与DCM组相比,心肌中GRP78、CHOP的表达水平有所下降(P<0.05)。上述实验结果从mRNA及蛋白水平上证明了ERS在DCM心肌损害中被激活,而缬沙坦可以发挥抑制ERS激活的作用。7.DCM大鼠心肌组织中存在XBP1的激活并且缬沙坦可以抑制XBP1的活化半定量RT-PCR和Western blot检测显示,与正常对照组相比,DCM组XBP1-s表达显著增加(P<0.05)；DCM+缬沙坦组与DCM组相比,心肌组织中XBP1-s表达有所下调(P<0.05)。上述实验结果表明DCM心肌组织中存在XBP1的活化,而缬沙坦治疗可以抑制XBP1的激活。结论1.通过一次性注射STZ,成功构建了DCM大鼠模型,为DCM发病机制的研究提供了可靠的动物模型。2.验证了DCM病程中心肌重构的存在,证明了心肌细胞凋亡的增加在DCM病程中发挥了重要作用。3.DCM心肌组织GRP78、CHOP表达上调,证实了DCM病程中存在ERS的激活。4.DCM心肌组织中存在ERS关键因子XBP1的活化,证明DCM病程中存在着XBP1调控的ERS相关凋亡途径的激活。5.缬沙坦能够抑制DCM大鼠心肌细胞凋亡,改善心肌重构,其作用靶点可能与抑制XBP1的激活有关。研究背景糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是糖尿病最重要的靶器官并发症之一,以心肌细胞肥大、凋亡以及间质纤维化为主要病理特征。DCM疾病早期主要表现为心肌细胞肥大以及少量的心肌细胞凋亡；随着疾病的发展,凋亡逐渐增多,使得心肌细胞数目大量减少,并最终加重DCM病程中的心肌重构与功能障碍。内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ERS)过程中的未折叠蛋白反应(unfolding protein response, UPR)与糖尿病病程中葡萄糖、脂肪代谢紊乱存在着密切的联系。当机体处于代谢障碍的状态下,内质网(endoplasmic reticulum,ER)作为细胞蛋白质和脂质合成加工的主要场所,负荷剧增,触发UPR,导致ERS的发生。ERS可能是糖脂代谢紊乱中尤为关键的环节,而葡萄糖利用障碍导致的心肌能量代谢紊乱是DCM心肌细胞凋亡的主要原因之一。因此,ERS可能在DCM心肌细胞凋亡过程中发挥了极其重要的作用。X盒结合蛋白1(X-box binding protein1, XBP1)是调控ERS的关键分子。ERS时,XBP1mRNA由ATF6诱导并经IRE1特异性剪切,产生一种高活性转录因子XBP1-s,从而激活UPR。适度的ERS时,剪接后活化的XBP1能够特异性的与未折叠蛋白反应元件(unfolded protein response element, UPRE)结合,诱导内质网降解增强因子α甘露糖苷酶样蛋白(ER degradation enhancing α-mannosidase-like protein, EDEM)基因的转录,增强GRP78等分子伴侣蛋白的转录活性,激活内质网相关性降解(ER associated degration, ERAD),促进未折叠和错误折叠糖蛋白的降解,从而促进了细胞的存活。然而,持续严重的ERS时,活化后的XBP1则与内质网应激元件(ER stress element, ERSE)相结合,激活相关的细胞凋亡信号。而C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)作为C/EBP家族中碱性亮氨酸拉链蛋白(basic region leucine zipper)的转录因子,它的启动子恰好包含了至少两种ERSE序列。因此,在DCM病程中,XBP1-s可能通过诱导转录因子CHOP的激活,导致心肌细胞的凋亡。CHOP在哺乳动物细胞中表达广泛,参与细胞能量代谢、增殖、凋亡等多种病理生理过程。CHOP通路是ERS诱导细胞凋亡的三条主要通路之一,也是最为重要的ERS诱导细胞凋亡的通路。然而,XBP1-s和CHOP的表达均有组织特异性,并且随刺激因素的不同其表达活性亦存在差异。在DCM心肌组织中,是否存在XBP1-s和CHOP的表达上调,以及CHOP基因的转录激活是否与XBP1-s有关,目前国内外尚缺乏相关研究。线粒体是细胞的能量工厂,也是调控细胞凋亡的最重要细胞器之一,而CHOP诱导的细胞凋亡可能是通过线粒体凋亡途径实现的。线粒体依赖的凋亡途径受Bcl-2家族成员的调控,p53上调凋亡调控因子(p53upregulated modulator of apoptosis, Puma)是近年来发现的Bcl-2家族BH3-only促凋亡蛋白成员。有研究发现Puma极有可能是联系ERS和线粒体凋亡的重要因子。Puma通过直接或间接地与抑制凋亡的Bcl-2蛋白发生相互作用,解除Bcl-2/Bcl-xL对促凋亡的Bax/Bak蛋白的抑制作用,促使Bax/Bak构象发生改变后在线粒体膜上形成寡聚物,导致线粒体膜通透性增加,线粒体内的cytochrome c释放入胞质,启动caspase级联反应,导致cleaved caspase3表达上调,最终发生细胞凋亡。生理状态下,Puma的表达量非常低,而当诸如DNA损伤、ERS等多种应激刺激发生时,各种应激刺激通过p53依赖性和非依赖性的细胞凋亡途径,诱导Puma的转录表达,进而调控线粒体凋亡途径,导致细胞凋亡。有研究表明,ERS发生时,Puma表达相应上调,诱导细胞凋亡,提示ERS与Puma之间可能存在着一定的联系。然而,在DCM病程中,ERS相关凋亡信号是否通过线粒体凋亡途径介导心肌细胞凋亡?CHOP和Puma是否在这个过程中发挥了极为重要的桥梁作用?这一系列问题仍有待进一步探讨。基于以上讨论,本课题提出以下假说：在DCM病程中,ERS通过激活XBP1,诱导CHOP基因的转录及表达上调,并进一步激活Puma介导的线粒体凋亡途径,促进心肌细胞的凋亡。围绕这一假说,本研究采用高糖刺激原代乳鼠心肌细胞诱导ERS的发生,探讨XBP1、CHOP、Puma三种关键因子在ERS介导的心肌细胞凋亡过程中所发挥的作用及其三者之间可能存在的信号转导机制,为阐明ERS介导心肌细胞凋亡的相关通路提供全新的理论依据。研究目的1.验证高糖诱导ERS介导心肌细胞凋亡的作用。2.探讨XBP1、CHOP、Puma在ERS介导的心肌细胞凋亡过程中所发挥的作用。3.明确XBP1、CHOP、Puma三者之间可能存在的信号转导机制。4.证实高糖刺激下,ERS可能通过XBP1/CHOP/Puma途径诱导心肌细胞凋亡研究方法1.原代乳鼠心肌细胞的培养取1-3天的Wistar新生乳鼠心脏,剪碎、胰酶消化、差速贴壁,获取心肌细胞。生长至亚融合状态,可观察到心肌细胞搏动,进行原代心肌细胞培养。2.原代心肌细胞的鉴定采用肌钙蛋白T单克隆抗体进行免疫荧光染色对原代培养的心肌细胞进行检测,荧光显微镜下观察、拍照。3.实验设计在体外模拟糖尿病状态,加入不同的刺激因素,研究心肌细胞干预后的变化。对细胞分别进行以下处理：心肌细胞用一定浓度梯度的D-葡萄糖(5.5mmol/L16.7mmol/L和33.3mmol/L)处理；心肌细胞用27.8mmol/L甘露醇+5.5mmol/L D-葡萄糖处理作为对照；高糖(33.3mmol/L D-葡萄糖)+XBP1siRNA孵育细胞；高糖(33.3mmol/L D-葡萄糖)+CHOP siRNA孵育细胞。4.小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)技术采用siRNA技术分别抑制XBP1和CHOP的表达,观察二者之间及其下游因子的表达变化。将提取的原代乳鼠心肌细胞分别用XBP1和CHOP的siRNA预处理24小时,再给予高糖刺激48h,收取细胞,通过流式细胞技术和Western blot等技术检测其下游因子的表达及细胞凋亡水平。5.流式细胞仪检测心肌细胞凋亡水平采用流式细胞技术检测心肌细胞的凋亡情况,计算心肌细胞的凋亡率6. Western blot检测收集细胞,提取总蛋白和细胞核蛋白,分别经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、转膜、蛋白印记、显色等步骤,检测GRP78, XBP1-s, CHOP, Puma, cleaved caspase3和cytochrome c的表达。7.半定量RT-PCR和实时定量RT-PCR检测收集细胞,提取总RNA,经逆转录反应获得cDNA,以β-actin作为参照,通过半定量RT-PCR技术检测XBP1-s的mRNA表达,实时定量RT-PCR技术检测GRP78, CHOP和Puma的mRNA表达。研究结果2.1D-葡萄糖刺激心肌细胞凋亡呈现浓度梯度依赖性分别以低糖(含5.5mmol/L D-葡萄糖)、中糖(含16.7mmol/L D-葡萄糖)、高糖(含33.3mmol/L D-葡萄糖)和甘露醇(含27.8mmol/L甘露醇+5.5mmol/L的D-葡萄糖)刺激心肌细胞48h,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡情况,结果显示中糖及高糖刺激组较低糖刺激组凋亡率明显增加(P<0.05)；而甘露醇对照组的细胞凋亡率与低糖组相比未见明显变化(P>0.05)。由此可见,高浓度D-葡萄糖刺激可诱导心肌细胞凋亡,而刺激心肌细胞凋亡的最佳D-葡萄糖浓度为33.3mmol/L,刺激时间为48h。2.2高糖刺激心肌细胞触发ERS分别以低糖(含5.5mmol/L D-葡萄糖)、高糖(含33.3mmol/L D-葡萄糖)和甘露醇(含27.8mmol/L甘露醇+5.5mmol/L的D-葡萄糖)刺激心肌细胞48h,收取三组细胞采用实时定量RT-PCR和Western blot的方法进行检测,结果显示：高糖刺激组与低糖对照组相比,ERS的标志性因子GRP78mRNA和蛋白表达水平均上调(P<0.05)；而甘露醇对照组与低糖对照组相比,GRP78mRNA和蛋白表达水平未见明显变化(P>0.05),说明高糖刺激心肌细胞能够诱导ERS的发生。2.3高糖刺激导致心肌细胞凋亡过程中XBP1-s、CHOP和Puma的表达上调对低糖、高糖、甘露醇对照组细胞中XBP1-s、CHOP和Puma的表达进行半定量RT-PCR、实时定量RT-PCR和Western blot检测,结果显示：高糖组与低糖对照组相比,XBP1活化因子XBP1-s、CHOP和Puma的mRNA和蛋白表达水平均上调(P<0.05)；而甘露醇对照组与低糖组相比,XBP1-s、CHOP和Puma的mRNA和蛋白表达水平均未见明显变化(P>0.05)。同时,对各组中的凋亡因子cleaved caspase3、cytochrome c进行Western blot检测,结果显示高糖组与低糖对照组相比,cleaved caspase3、cytochrome c表达显著增加(P<0.05)；而甘露醇对照组与低糖组相比,cleaved caspase3、cytochromec表达未见显著变化(P>0.05)。由此可见高糖刺激能够促使ERS关键因子XBP1, CHOP和Puma的表达上调,心肌细胞凋亡增加。上述实验结果提示XBP1-s, CHOP和Puma在高糖刺激触发ERS介导的心肌细胞凋亡这一过程中发挥着重要的作用。2.4XBP1siRNA及CHOP siRNA可以抑制高糖刺激导致的心肌细胞凋亡(1)将原代培养的心肌细胞应用XBP1siRNA转染心肌细胞24小时后,收取细胞并用半定量RT-PCR和Western blot法验证siRNA的转染效力,结果显示：siRNA转染组与对照组相比,XBP1的mRNA及蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。上述结果提示XBP1siRNA能够有效抑制XBP1的表达。(2)将原代培养的心肌细胞应用CHOP siRNA转染心肌细胞24小时后,收取细胞并用实时定量RT-PCR及Western blot法验证siRNA的转染效力,结果显示：siRNA转染组与对照组相比,CHOP的mRNA及蛋白表达水平显著下调(P<0.05)。提示CHOP siRNA能够有效抑制CHOP的表达。(3)采用流式细胞技术对低糖组、高糖组、XBP1siRNA组和CHOP siRNA组的细胞凋亡率进行检测,结果显示XBP1siRNA组与高糖组相比,心肌细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；CHOP siRNA组与高糖组相比,心肌细胞凋亡率亦显著降低(P<0.05),证实XBP1siRNA及CHOP siRNA可以抑制高糖刺激导致的心肌细胞凋亡,说明XBP1及CHOP在高糖诱导的心肌细胞凋亡过程中发挥了重要的作用。2.5高糖通过XBP1/CHOP/Puma通路介导心肌细胞凋亡本实验中,我们采用siRNA技术抑制分别XBP1和CHOP的表达,观察两者分别抑制后XBP1-s、CHOP和Puma的表达情况。分别对低糖组、高糖组、XBP1siRNA组(先应用XBP1siRNA转染心肌细胞24小时后,再予以高糖刺激48小时)和CHOP siRNA组(先应用CHOP siRNA转染心肌细胞24小时后,再予以高糖刺激48小时)进行半定量RT-PCR、实时定量RT-PCR和Western blot检测。Western blot的结果显示：在应用了XBP1siRNA之后,XBP1-s蛋白表达显著下调(P<0.05)；与此同时,CHOP和Puma的表达也伴随着XBP1-s的表达减少而显著下调(P<0.05),提示CHOP和Puma二者的表达受XBP1激活的调控,二者可能是XBP1的下游因子。在使用了CHOP siRNA之后,XBP1-s的表达未受到显著影响(P>0.05)；与此同时,伴随着CHOP表达的下调,Puma的表达也随之下降(P<0.05),说明抑制CHOP蛋白的转录激活对XBP1的表达无显著影响,但对Puma的表达有显著下调作用,这进一步提示CHOP是XBP1的下游因子,而Puma则更可能位于CHOP的下游。同时,通过半定量RT-PCR、实时定量RT-PCR检测上述因子的mRNA表达水平,所得到的结论与上述蛋白检测结果相吻合。综上所述,我们得出了XBP1、CHOP和Puma三者之间存在着上下游关系,XBP1/CHOP/Puma通路在高糖刺激触发ERS所导致的心肌细胞凋亡过程中发挥了至关重要的作用。结论1.验证了高糖刺激可以通过激活ERS进而诱导心肌细胞凋亡。2.首次证明XBP1在高糖刺激下ERS介导的心肌细胞凋亡过程中发挥了重要作用。3.首次证明了高糖刺激下,XBP1/CHOP/Puma信号转导通路在ERS介导的心肌细胞凋亡中发挥了重要作用