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[研究目的]骨肉瘤是最常见的原发恶性骨肿瘤之一,青少年较为常见,它影响快速增殖的骨骼。数据统计显示,每年估计全球有400万人发病。过去的十年中,手术结合化疗等手段,能较有效的抑制骨肉瘤的生长和浸润。目前尽管患者能得到积极的治疗,但骨肉瘤的复发、转移和化疗耐受等仍然是导致治疗失败的主要原因。骨肉瘤的5年生存率约50%至70%,局部复发约占患者的10%,生存率低。骨肉瘤患者死亡的主要原因是由于肿瘤细胞的复发、转移,因此,目前需寻找有效的抑制肿瘤细胞转移的方法,找出驱动骨肉瘤恶化、复发和转移的潜在分子机制,识别与预后相关的分子治疗靶点,以改善骨肉瘤患者的治疗效果和预后。在与肿瘤转移相关基因的基础研究中,microRNA(miRNA)已经成为一个新的探索热点。愈来愈多的研究结果显示,miRNA在身体正常功能的维系和疾病的发生、发展过程中具有重要的作用,同时参与调控肿瘤细胞增殖、凋亡、应激反应和发育等。在机体许多类型肿瘤的发生、侵润和转移中,miRNA的调节发生异常,如卵巢癌、肝癌、膀胱癌和结直肠癌等。在microRNA中,尤其miR-34a,被公认是一种肿瘤抑制因子,参与调控多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、粘附和凋亡等生理病理过程。miR-34a有许多靶基因,如p53、Eag1、Wnt和Notch,这些靶基因科以在骨肉瘤中调节多种细胞功能。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一种极其保守的激酶家族,它将信号从外界传递到细胞内,调节细胞的生长和分化。而在介导MAPK去磷酸化的酶中,最为重要的是蛋白酪氨酸磷酸酶超家族,称为双特异性蛋白白磷酸酶(DUSPs),其中DUSP1参与细胞周期中G0/G1期的过渡和细胞的凋亡的调节。有研究表明,miR-101作用DUSP1,影响索拉非尼处理下的的TGF-β分泌。抑制miR-940,促进DUSP1的表达,减弱JNK介导的肺癌细胞凋亡。然而,在骨肉瘤中,miR-34a在DUSP1上的调节尚不清楚。我们的研究旨在揭示miR-34a和DUSP1对骨肉瘤细胞增殖、迁移、粘附和凋亡等作用,及其对相关效应蛋白的影响,阐述其分子机制。了解miRNA对于骨肉瘤细胞的增殖、凋亡等的影响,有助于筛选出新的与分子预后有关的治疗靶点,为研发新的抗肿瘤药物及临床骨肉瘤的预防、诊断、治疗及预后提供参考。[研究方法]通过应用pre-miR-34a、anti-miR-34a和阴性对照,过度表达和降低表达miR-34a,探索miR-34a对骨肉瘤细胞的相关作用。通过MTT和克隆形成实验,检测miR-34a对细胞增殖的作用;通过Traswell细胞迁移实验,检测了 miR-34a对骨肉瘤细胞的迁移作用;通过流式细胞术实验,检测miR-34a对细胞周期和凋亡的作用;通过双荧光素酶报告基因分析实验、QPCR实验和western blot实验,检测miR-34a对DUSP1的表达调控,探讨其分子机制。[研究结果]miR-34a使骨肉瘤细胞停滞在G0/G1期,减少S期的比例,显著地抑制MG63细胞的增殖。同时,miR-34a对骨肉瘤细胞的迁移抑制达到了百分之六十,使细胞的凋亡增加六倍,抑制百分之八十的细胞的粘附。相反地,在U-20S细胞中转染anti-miR-34a,降低miR-34a的表达,可使细胞在G0/G1期比例减少,增加S期的比例,促进细胞的增殖,抑制了骨肉瘤细胞凋亡,促进了细胞粘附。在骨肉瘤中,双特异性磷酸化酶1(DUSP1)是miR-34a的直接靶基因,在MG63细胞中高表达DUSP1,使骨肉瘤细胞在G0/G1期比例下降,增加了 S期细胞比例,抑制了骨肉瘤细胞凋亡,促进细胞的增殖,增强了细胞的粘附能力。然而,在U-20S细胞中抑制DUSP1的表达,阻滞骨肉瘤细胞在G0/G1期,使S期细胞比例减少,抑制骨肉瘤细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,抑制骨肉瘤细胞的粘附能力。miR-34a负调控DUSP1,提高Bax表达,抑制Bcl-2表达,促进骨肉瘤细胞的凋亡;抑制细胞周期蛋白D1和E表达,阻滞骨肉瘤细胞于G0/G1期,抑制骨肉瘤细胞的增殖;提高E-钙黏蛋白的表达,降低β-catenin表达,抑制骨肉瘤细胞的粘附。[研究结论]miR-34a在骨肉瘤中,通过直接靶向作用DUSP1,抑制DUSP1的表达,抑制骨肉瘤细胞增殖,阻滞细胞于G0/G1期,抑制细胞迁移,抑制细胞粘附,促进细胞凋亡,发挥抑制骨肉瘤细胞的作用。