【摘 要】
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黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是一种常见的真菌毒素,由黄曲霉和寄生曲霉等若干真菌在一定条件下产生的次级代谢物,具有极强毒性,可普遍污染饲料及食品原料,可直接或间接的威胁人和动物的健康,每年都会造成数以亿计的经济损失。与物理及化学降解黄曲霉毒素相比,生物降解法具有更优的特性,且安全性较高。本文主要利用索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)降解AFB1,研究
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黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1,AFB1)是一种常见的真菌毒素,由黄曲霉和寄生曲霉等若干真菌在一定条件下产生的次级代谢物,具有极强毒性,可普遍污染饲料及食品原料,可直接或间接的威胁人和动物的健康,每年都会造成数以亿计的经济损失。与物理及化学降解黄曲霉毒素相比,生物降解法具有更优的特性,且安全性较高。本文主要利用索诺拉沙漠芽孢杆菌(Bacillus sonorensis)降解AFB1,研究了该菌株的降解特性,并对其降解活性物质进行了初步探讨。具体研究内容如下:(1)通过单因素试验(接种量、初始p H、发酵时间和发酵温度)探究了索诺拉沙漠芽孢杆菌对降解AFB1效果的影响。结果表明,该菌株降解AFB1的最适接种量为5%,最适培养基初始p H为7,最适发酵时间为48 h,最适发酵温度为37°C。在此单因素试验结果基础上,通过响应面试验设计对降解AFB1的发酵条件进行优化,最优发酵条件为:接种量6.2%、发酵时间47.9 h、发酵温度38.5°C,降解率较优化前提高了4.97%。随后对黄曲霉毒素主要产生菌进行抑菌观察,结果表明,该菌株对黄曲霉和寄生曲霉的生长无抑制作用。(2)测定不同组分(无细胞上清液、菌体细胞和细胞破碎液)对AFB1降解的能力,结果表明,无细胞上清液对AFB1的降解率为90.60%,菌体细胞对AFB1的降解率为29.74%,细胞破碎液对AFB1的降解率为41.10%。由此得到,起降解作用的活性物质成分主要分布在无细胞上清液中。针对无细胞上清液进行不同方式的处理,验证降解AFB1的活性物质成分是否有蛋白参与。首先,验证热处理对无细胞上清液的降解活性是否存在影响,沸水浴(15 min)处理对降解活性无显著影响(P>0.05),经高温高压(121°C,20 min)处理后,无细胞上清液对AFB1的降解率从90.60%降低至78.94%(P<0.05)。两种热处理方式说明无细胞上清液中含有的有效降解活性成分具有一定的耐热性。随着降解温度的升高降解AFB1所用时间逐步缩短,降解温度为90°C时,终浓度为1μg/m L的AFB1与无细胞上清液共同孵育12 h即可被完全降解。其次,通过蛋白酶K和SDS对无细胞上清液进行处理,其降解能力分别从90.60%下降至83.46%和45.72%,说明耐热的胞外酶类可能是降解AFB1主要活性物质。研究金属离子对无细胞上清液降解AFB1的影响,结果表明,Cu2+、Fe3+可促进无细胞上清液对AFB1的降解,Mn2+、Zn2+则不同程度的抑制了降解活性,而Mg2+对降解效果无影响(P>0.05)。(3)采用不同饱和度的硫酸铵分级沉淀无细胞上清液得到粗酶液,并研究了各级沉淀粗酶液对AFB1的降解效果。结果表明,不同硫酸铵饱和度处理对AFB1降解能力有所影响,不同浓度硫酸铵沉淀的粗酶液与AFB1共同孵育后,发现55%饱和度的硫酸铵沉淀能够分离出更多具有降解活性的物质,使AFB1的降解率达到51.17%,而硫酸铵饱和度80%时沉淀的去蛋白上清对AFB1的降解率为63.48%。将55%硫酸铵饱和度的沉淀复溶得到的粗酶液进行质谱检测,推断降解AFB1的活性物质可能是组成型蛋白。(4)荧光光谱检测显示AFB1降解产物的荧光明显减弱,判断其荧光特性减弱可能是内酯环断裂所造成。进一步分析了无细胞上清液和AFB1转化体系对猪小肠上皮细胞(IPEC-1)的细胞毒性,采用MTT法验证了无细胞上清液和其降解产物的毒副作用。结果表明,在本试验无细胞上清液浓度为1000μg/m L的范围内对IPEC-1细胞生长无抑制作用,即无毒副作用;AFB1被转化后的体系对IPEC-1细胞的存活率与空白对照组相比无显著差异(P>0.05),说明降解产物无毒性。
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