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胃癌是一种最常见的人类恶性肿瘤，居全球癌症死亡率的第二大原因，预后较差，在我国，5年期胃癌的生存率低于20%-25%。早期胃癌可以通过手术切除，辅以放化疗治疗，极大提高患者的5年生存率。可是中晚期胃癌治疗效果较差。随着人们对肿瘤研究的深入，人们意识到肿瘤生长微环境，尤其是肿瘤的血管生成，对肿瘤的生长转移的重要性。因此阻断肿瘤血管生成成为了人们研究肿瘤治疗的新方向。GX1-rmhTNFα是我们实验室采用基因重组技术制备的一种抑制胃癌新生血管形成的药物。rmhTNFα在我国已经批准上市用于治疗小细胞肺癌，GX1为我实验室通过噬菌体肽库筛选出来的靶向胃癌血管的环状小肽，于是我们采用基因重组技术制备出GX1-rmhTNFα。前期实验证明该药物通过GX1特异结合于胃癌新生血管，从而使rmhTNFα在胃癌细胞周围的新生血管富集，能有效地抑制胃癌血管生成，达到治疗胃癌的作用。目的:为了进一步加快GX1-rmhTNFα应用于临床治疗，本课题旨在通过全面检定采用基因重组技术构建的表达GX1-rmhTNFα融合蛋白的工程菌(DH5α/pBV-GX1-rmhTNFα)，从而建立稳定的适合大规模生产的工程菌菌种库，并建立发酵及纯化的稳定工艺。方法:对GX1-rmhTNFα工程菌进行全面检定，挑取目的蛋白表达水平高的菌种扩大培养；采用5L发酵罐，32℃培养工程菌至A600值达4～6，42℃诱导约4h后收菌，发酵过程，控制pH值在7.2，溶氧在30%左右，采用梯度流加的方法补料，连续发酵3批，验证发酵工艺的稳定性；表达产物经硫酸铵分段盐析及透析处理后活性为1.71×10~8IU/ml蛋白含量为5.918mg/ml，经SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF层析纯化，收集洗脱峰进行浓度、活性、纯度及Western blot分析。结果:工程菌经全面检定，证实该重组菌构建正确，目的蛋白表达量不低于10%，菌种稳定性较好，呈典型的大肠杆菌特征，适合建立工程菌菌库。连续发酵3批，湿菌收量均不低于200克，且各批菌体目的蛋白表达水平均在10%以上。目的蛋白经SP-Sepharose FF及Q-Sepharose FF柱层析纯化，最终纯化产物蛋白含量为0.901mg/ml,活性为5.97×10~8IU/ml，纯度可达95%以上，经Western blot检测，目的蛋白可与相应单抗发生特异性免疫反应。结论:采用基因重组技术构建的表达GX1-rmhTNFα融合蛋白的工程菌稳定，建立了简单可行的表达GX1-rmhTNFα融合蛋白的工程菌的发酵及纯化工艺，为GX1-rmhTNFα新药的产业化进程奠定基础。