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湿疹(Eczema)是由多种内外因素引起的皮肤炎症,急性期皮损以丘疱疹为主,有渗出倾向,慢性期以苔藓样变为主,易反复发作。本课题组前期研究发现,中药复方茯苓汤对小鼠变应性接触性皮炎有显著抑制作用[1],临床上治疗湿疹,疗效较好且副作用小,优于传统抗组胺药[2]。利用超高速液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾-质谱(UFLC-DAD-ESI-MS)技术对复方茯苓汤整方成分进行了定性和定量分析,初步研究了其主要成分的体外药物代谢及抗炎作用,证实芍药苷(Paeoniflorin,PF)是复方茯苓汤的主要活性成分之一且具有较好的抗炎活性,相关研究也证实PF具有明确的抗变态反应及抗炎作用[3,4]。T淋巴细胞(T lymphocyte)是淋巴细胞的主要组分,是机体免疫识别、应答以及调控的主要细胞,在免疫系统中处于主导地位[5]。T淋巴细胞在湿疹发病中起着关键性作用,前期研究证实PF可抑制活化的T淋巴细胞增殖,诱导其凋亡,并抑制IFN-y水平,PF治疗湿疹的抗炎机制需深入研究。NF-κB/MAPK信号通路作为经典的细胞信号转导通路,在诱导细胞促炎因子和抗炎因子的表达、聚集、激活和调节炎症反应等过程中发挥重要的作用。NF-κB是由RelA(P65)、Rel B、C-Rel、NF-κB2(P52)组成,其编码的产物由同源和各种异源的NF-κB/Rel蛋白二聚体构成,多为P50和P65,通过与其抑制蛋白IκB结合,参与下游信号转导通路,激活一系列激酶,从而调控相关基因表达[6]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是在真核细胞内广泛存在的一类丝/苏氨酸蛋白激酶,细胞外信号或刺激如炎性细胞因子、生长因子、细菌复合物等可以将MAPK信号通路激活,激活后可以将细胞外信号逐级放大传至细胞核内,调控基因表达[7]。MAPKs家族包括:ERK(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)、p38MAPK、ERK3、JNK(Jun N-terminal kinase,JNK)、BMK1/ERK5、ERK27、ERK8和NLK等8个亚家族。各个通路受不同的刺激因素作用后,激活转录因子,介导生物学效应[8]。目的:研究PF对活化的人外周血T淋巴细胞NF-κB信号通路因子(NF-κB、IκB-α)、MAPK信号通路因子(JNK、ERK、p38)的影响,研究其抗炎机制。方法:对人外周血T淋巴细胞进行分离与体外培养,CD3联合CD28单抗活化T淋巴细胞,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同浓度PF对活化的T淋巴细胞NF-κB p65、IκB-α 磷酸化、磷酸化 p38(p-p38)、磷酸化 ERK1/2(p-ERK1/2)和磷酸化 JNK(p-JNK)表达的影响。结果:1、PF抑制活化的T淋巴细胞NF-κB p65表达:在0-120min内,随时间延长,活化的T淋巴细胞中NF-κB p65表达增加。CD3+CD28组NF-κB p65含量显著高于空白对照组(P<0.01),PF呈浓度依赖性抑制p65表达,其中1OμM PF组与CD3+CD28组比较能显著抑制NF-κBp65表达(P<0.05)。2、PF抑制活化的T淋巴细胞NF-κB信号通路IκB-α磷酸化:在0-120min内,IκB-α的含量随时间的延长而减少,在60min时几乎完全降解。活化的T淋巴细胞中P-IκB-α含量高于空白对照组(P<0.05),1μM PF、5μM PF与CD3+CD28组比较,能抑制T淋巴细胞P-IκB-α的表达(P<0.01),1OμMPF组与CD3+CD28组比较,能显著抑制T淋巴细胞P-IκB-α的表达(P<0.001)。3、PF对活化的T淋巴细胞MAPKs信号通路因子JNK、ERK磷酸化无影响:在0-120min内,JNK、ERK磷酸化在1Omin时表达最高。与CD3+CD28组比较,1μM PF、5μM PF、1OμM PF对MAPKs信号通路因子ERK、JNK的磷酸化表达无显著性差异(P>0.05)。4、PF抑制活化的T淋巴细胞MAPKs信号通路因子p38磷酸化:在0-120min内,p38磷酸化在1Omin时表达最高。P-p38表达水平随着PF浓度增加而减少,5μM PF组与CD3 + CD28组比较,能够抑制T淋巴细胞P-p38的表达(P<0.05),10μM PF组与CD3+CD28组比较,能显著降低T淋巴细胞P-p38的表达(P<0.01)。结论:1、PF呈浓度依赖性抑制活化的T淋巴细胞中NF-κB p65表达及IκB-α磷酸化,提示PF可能通过NF-κB信号通路抑制T淋巴细胞活化。2、PF呈浓度依赖性抑制活化的T淋巴细胞中p38磷酸化,PF对活化的T淋巴细胞中JNK、ERK磷酸化无影响。3、NF-κB信号通路和p38磷酸化参与PF介导的对人T淋巴细胞的免疫抑制,表明PF作为重要的抗炎药物值得深入研究。