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滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)在自然条件下主要感染鸡和火鸡,引起渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎,导致蛋鸡的减产和肉鸡的胴体废弃率升高。MS的传播效率高,既可垂直传播,又可水平传播。近年来,MS感染在我国的流行范围广,发病率高,造成的经济损失巨大。目前,MS-H是我国唯一批准使用的商品化弱毒疫苗,但由于其售价较高,仅有少数种禽场使用。因此,研制成本较低且与国内流行株抗原性一致的MS弱毒疫苗是目前的迫切需要。1 我国MS流行菌株的致病性研究基于近三年来本实验室从国内不同省份分离到的46个基因K型MS菌株(国内流行的优势基因型),选取部分不同来源的菌株(Ningxia/2017-1、Ningxia/2019-3和Shandong/2017-2)进行了致病性研究。研究分别采用胸腔气囊内注射和气管内接种两种方式进行攻毒。经胸腔气囊内注射途径接种14日龄SPF鸡时,Ningxia/2017-1引起的气囊炎发生率为8/12,Ningxia/2019-3和Shandong/2017-2引起的气囊炎发生率分别为11/12和13/13。Ningxia/2017-1引起的气囊损伤严重程度明显低于Ningxia/2019-3 和 Shandong/2017-2(p<0.05)。Shandong/2017-2 引起的气囊损伤严重程度略高于Ningxia/2019-3,但没有显著差异。Shandong/2017-2引起的足垫损伤发生率为5/13,死亡率为4/13,而Ningxia/2017-1和Ningxia/2019-3不引起足垫损伤和鸡只死亡。将Shandong/2017-2的菌液进行梯度稀释,并分别通过胸部气囊内注射方式接种30日龄SPF鸡,以测定Shandong/2017-2的最小致病剂量。结果表明菌液滴度最低为5×105 CCU/ml时可引起全部鸡只发病。对14日龄雏鸡经气管内接种途径进行攻毒时,三个毒株攻毒组试验鸡的临床表现均显著轻于通过气囊内注射攻毒,但3个毒株的致病性强弱程度在两种攻毒方式下表现一致。Ningxia/2017-1株毒力最低,在接种14天后气囊损伤的发生率为20%,未发生跗关节或足垫肿胀。Ningxia/2019-3株毒力居中,在接种14天后气囊损伤的发生率为30%,未发生跗关节或足垫肿胀。Shandong/2017-2株毒力最强。接种14天后气囊损伤的发生率为40%,且出现5例喉头出血,其中3例伴有气管出血;1例跗关节肿胀,肿胀关节内可见脓性渗出。各组气囊损伤评分Ningxia/2017-1组最低,但组间没有统计学差异。本章建立了 MS感染的病理模型,整理出了气囊损伤和足垫损伤的评分方法,为后续试验提供参考。研究结果表明,Shandong/2017-2表现出了最强的致病性,可以作为后续试验中的标准强毒菌株。Ningxia/2017-1致病性最弱,可以其作为培育MS弱毒菌株的母本菌株。2 温度敏感型MS弱毒株的培育温度敏感型(temperature sensitive,ts+)MS弱毒疫苗菌株仅能在感染鸡的上呼吸道定植,不能发生全身性感染,在定植部位通过“占位效应”发挥竞争性排斥作用阻断MS野毒株的感染。本研究采用三种不同浓度的N-硝基-N’-甲基-N-亚硝基胍(N-nitro-N’-methyl-N-nitrosuguanidine,NTG)对连续传代的Ningxia/2017-1菌株进行诱变,获得了 66个单菌落子代克隆菌株。从这些子代菌株中筛选出了 9个ts+菌株。分别通过5周龄SPF鸡足垫内接种途径和1日龄雏鸡胸部气囊内接种途径对9个ts+菌株进行致病性测定。在5周龄SPF鸡足垫内接种试验中,M2、M3、5-18和18-22接种4周后没有引起临床症状或病理变化,且在接种后第2、3、4周引发的抗体水平低于Ningxia/2017-1亲本株的接种组。M10、M20和5-9仅能引起轻微的足垫肿胀,但不能导致气囊炎的发生。在1日龄雏鸡胸部气囊内接种试验中,5-9和5-18不引起气囊炎。M2、M3、M10和18-6均可引起轻度的气囊炎,相互之间没有显著差异。M14引起的气囊炎发生率为7/11,且气囊损伤评分显著高于其它菌株(p<0.05)。M20和18-22组的气囊炎损伤评分略高于M14之外的接种组,但是与包括M14在内的组均没有显著差异。根据致病试验结果选择M2和5-9进一步进行免疫攻毒保护效力试验,以商品化活疫苗(MS-H株)作为对照。于7日龄对SPF鸡进行免疫,免疫25天后使用强毒株Shandong/2017-2进行攻毒。结果显示,5-9可提供30%的保护率,MS-H可提供50%的保护率,而M2仅有10%的保护率。5-9和MS-H接种组的气囊损伤评分均值均显著低于对照组(p<0.05),但两个免疫组之间没有统计学差异。M2接种组的气囊损伤评分显著高于MS-H接种组(p<0.05)。M2、5-9和MS-H接种后第7、14、21和25天的血清样品均为阴性,这表示3个菌株在接种后25天的时间内均未能引起体液免疫反应。在后续工作中,仍需要对本研究中获得的其他弱毒菌株进行系统的安全性和免疫保护效力评价,以期最终研制一款可应用于临床的商品化MS减毒活疫苗。综上所述,本研究首先通过动物试验筛选出毒力较低的Ningxia/2017-1作为培育减毒株的母本菌株,之后使用不同的方式对其进行诱导突变。通过动物实验对ts+的子代菌株进行筛选,最终发现了具有低致病性且能够提供一定免疫保护作用的菌株5-9,为进一步开发MS弱毒疫苗奠定了基础。