基于TMT技术针刺太冲、太溪对SHR下丘脑蛋白表达差异研究

来源 :广州中医药大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:yongren803
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目的:
  从一般情况、病理形态学、分子生物学和蛋白质组学四个层次,通过观察针刺太冲、太溪后自发性高血压大鼠的体重、血压、大脑HE染色、大脑尼氏染色、基于体外等重同位素标记法的相对/绝对定量蛋白质组学(Tandem Mass Tag,TMT)技术及其验证等指标。此外,为深入探讨课题前期功能磁共振结果在分子生物学层面的机制。最终,尝试寻求针刺对自发性高血压大鼠的降压机制、筛选关键蛋白,为阐明针灸降低血压的原理提供理论和实验依据。
  方法:
  采用STATA14.0统计软件以原始血压为分层条件按照随机区组设计将SHRs随机分成3组:模型组、冲溪组、非穴组,每组12只。WKY大鼠不分组。
  针灸处方:太冲(双)、太溪(双)、非穴(双)。
  操作方法:在大鼠清醒状态下行针刺捻转手法,平补平泻,于每天上午8点30开始进行,左右两侧穴位同时进行针刺,直刺,先左侧穴位行针2.5min,然后右侧穴位行针2.5min,每次持续总共时间5min,针刺每日1次,逢周日休息一天,连续针刺4周,共针刺24次。捻转频率为80±5次/min,捻转幅度180±5度。每次针刺时,将宽松黑色棉袜罩住大鼠头颈上半身,露出下肢针刺部位,此时大鼠处于黑暗环境,可保持安静稳定状态,便于针刺操作及保护针刺人员被大鼠抓伤或咬伤。所有针刺操作由固定一人进行。正常组与模型组不给予针刺,采用相同黑袜罩住,抓取固定5min。
  实验中,分别于实验前后记录大鼠体重;实验前、第一周结束时、第二周结束时、第三周结束时及实验完毕后测量并记录各组大鼠血压值。实验结束后立即取材,采用HE染色和尼氏染色观察大鼠下丘脑的一般病理形态结构;通过体外等重同位素标记法的相对/绝对定量蛋白质组学(TMT)技术对各组大鼠下丘脑蛋白表达进行分析寻找差异蛋白;采用Western blot验证关键差异蛋白的表达情况。
  结果:
  1.各组大鼠体重改变情况
  实验期间,各组大鼠体重均有增长。实验前后体重增加值方面,模型组与正常组相比差异不具有统计意义(P>0.05),模型组实验前后体重增加值大于冲溪组和非穴组(P<0.05),冲溪组和非穴组相比差异不具有统计学意义(P>0.05)。
  2.各组大鼠血压测量结果
  实验前,正常组血压小于其他三组(P<0.05),其余各组两两比较差异无统计学意义。第一周末,正常组血压小于其他三组(P<0.05),其余各组两两比较差异无统计学意义。第二周末,正常组血压小于其他三组(P<0.05),冲溪组血压小于非穴组(P<0.05),其余各组两两比较差异没有统计学意义。第三周末,正常组血压小于其他三组(P<0.05),冲溪组血压小于模型组(P<0.05),冲溪组血压小于非穴组(P<0.05),模型组和非穴组比较差异没有统计学意义。第四周末,正常组血压小于其他三组(P<0.05),冲溪组血压小于模型组(P<0.05),冲溪组血压小于非穴组(P<0.05),模型组和非穴组比较差异没有统计学意义。且体重和血压的差值不具有相关性(P>0.05)。
  3.各组大鼠大脑形态学实验结果
  下丘脑方面,各组大鼠下丘脑HE染色及尼氏染色后所得病理结果中,与同脑区正常组相比较,未观察到明显的病理变化,如神经元细胞核固缩、深染、细胞核消失等。但相较于正常组,其余各组细胞总数及尼氏体数量均有不同程度减少。细胞总数及尼氏体数量从多到少依次是:正常组、冲溪组、非穴组、模型组。
  4.蛋白质组学实验结果
  蛋白组鉴定结果表明,共鉴定得到6548个蛋白,其中自发性高血压大鼠模型组与正常组WKY大鼠相比较差异具有统计学意义的蛋白124个,在模型组自发性高血压大鼠中73个蛋白表达调高。
  冲溪组与模型组相比较,其中差异具有统计学意义的蛋白69个,在冲溪组中42个蛋白表达调高。
  非穴组与模型组相比较其中差异具有统计学意义的蛋白30个,在非穴组中26个蛋白表达调高。
  模型组和正常组相比、冲溪组和模型组相比共有差异蛋白14个.
  5.可重复性和差异蛋白Western blot验证结果
  采用计算机生成随机数字的方法在正常组和模型组差异蛋白中抽取5个对体外等重同位素标记法的相对/绝对定量蛋白质组学(TMT)实验的可重复性进行验证。在上述4个三组共有差异蛋白中,结合前述实验结果和已有文献,推测半乳糖凝集素3(Lgals3)、脂肪酸结合蛋白7(Fabp7)、外周蛋白(Prph)与高血压发病过程和针灸疗效机制密切相关,并以Western blot进行验证确认。
  可重复性结果方面,经过两次验证,上述五个蛋白在TMT实验和Western blot实验中表现出来的趋势一致,故可认为TMT实验重复性良好,可进行下一步验证。
  关键蛋白方面,上述三个重点蛋白在TMT实验和Western blot实验中表现出的趋势一致。
  结论:
  1.针刺可以控制大鼠体重增长,但无论太冲、太溪和非穴均表现出这一现象且非穴组没有血压降低,故不能认为控制大鼠体重是降压机制之一。
  2.针刺太冲、太溪可以降低自发性高血压大鼠的血压,但并不能将其恢复至正常水准。
  3.针刺太冲、太溪对SHRs降压作用在病理形态学上的可能机制在于减少或阻止下丘脑的细胞减少和凋亡,解除细胞增殖能力的抑制,并且通过多样本定量统计分析进行了初步的证实。而从生理机制层面,针刺通过对N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体信号传导的调节,调整下丘脑室旁核肾上腺髓质素含量水平、调节Toll样受体4(TLR4)所参与的促炎细胞因子生成及脑源性神经营养因子(BDNF)的含量水平而实现下丘脑的保护。最终通过上述多种机制,而使得一系列与下丘脑相关的血压调控途径得到调整,实现降压目的。
  4.模型组和正常组相比较的124个差异蛋白主要涉及到阴离子跨膜转运体、结构分子、金属离子跨膜转运蛋白、无机阳离子跨膜转运蛋白、次要活动的跨膜转运蛋白的活性,参与了囊泡定位的建立、囊泡定位、神经递质水平的调节、神经递质的运输、建立细胞器本地化、细胞器本地化、学习或记忆、认识、单价无机阳离子运输、突触传递、对金属离子的响应,集中于中间丝、中间丝细胞骨架、网格蛋白包被的囊泡、囊泡膜、细胞质小泡膜、突触后密度、包被的囊泡、细胞投影膜、轴突、蛋白质-DNA复合物、分泌颗粒、蛋白质细胞外基质、细胞体和神经元细胞体。这些蛋白及其生物学过程、分子功能、细胞组分和所参与的通路极可能为自发性高血压大鼠血压升高的发病机制。
  5.冲溪组和模型组相比的差异蛋白则参与了谷胱甘肽代谢通路、肌萎缩性侧索硬化(ALS)通路、外源性化学物质的细胞色素P450代谢通路、磷脂酰肌醇信号系统通路、帕金森病通路、心肌收缩通路、药物代谢通路、缝隙连接通路、胰腺分泌通路、白细胞跨内皮迁移通路、紧密连接通路、系统性红斑狼疮通路、阿尔茨海默氏病通路、亨廷顿氏病通路,共计14条。这些通路则可能为针刺太冲、太溪降低自发性高血压大鼠血压在下丘脑的机制,具体包括通过对谷胱甘肽代谢通路的调节而产生的包括抗氧化、解毒等效果,经外源性化学物质的细胞色素P450代谢通路可能产生舒张血管平滑肌、血管新生和抑制炎症、抗凋亡具有调节作用,可能通过磷脂酰肌醇信号系统通路对细胞分裂、凋亡等具有调节和抑制作用,可能在缝隙连接通路的作用下对血管平滑肌细胞增殖有调节效应,并调节细胞间紧密连接。但结果同时显示这些蛋白和一系列神经退化性疾病相关,提示针刺太冲、太溪对这一系列疾病可能具有一定调节作用。
  6.针刺太冲、太溪在下丘脑的降压机制可能涉及到模型组/正常组/冲溪组共有的14个差异蛋白。综合考虑TMT蛋白组学实验结果、生物信息学分析结果及已有文献重点选取半乳糖凝集素3(Lgals3)、脂肪酸结合蛋白7(Fabp7)、外周蛋白(Prph)这三个蛋白,作为针刺降压机制在下丘脑可能的关键蛋白或靶向作用蛋白。
  7.TMT实验具有可重复性,上述三个关键蛋白在TMT实验和Western blot实验中表现出的趋势一致。模型组SHRs相较于正常组大鼠下丘脑Lgals3、Fabp7、Prph均显著上调,而这三种蛋白都被报道与高血压有关,针刺太冲、太溪对SHRs下丘脑Lgals3、Fabp7、Prph的表达具有下调作用。
  8.半乳糖凝集素3是一种已有已经明确证实与心血管疾病风险和血管内皮细胞迁移有着明确正相关的蛋白,针刺对下丘脑半乳糖凝集素3的表达下调调控血压的机制可能是通过对下丘脑神经轴突、树突的生长调节、突触形成、血管内皮细胞迁移的调节,通过JAK/STAT和NF-κB通路对炎症反应和细胞凋亡等过程;脂肪酸结合蛋白也是一种已证实与高血压呈正相关的蛋白,而针刺对下丘脑脂肪酸结合蛋白7的表达下调则可能是通过对脂质代谢的调控,进一步减少炎症通路激活、减少血管内皮损伤、调节PI3K/AKT通路以控制血管内皮和血管平滑肌细胞的异常增生以及调整睡眠觉醒周期和减少焦虑情绪;外周蛋白是已被报道与血压有关的蛋白,并且与神经元凋亡有密切关系,而下丘脑受损则可能直接影响其对血压的调控作用。针刺对下丘脑外周蛋白的表达下调调控血压的机制可能是与减少神经细胞的凋亡、减少表达而降低神经毒性、调控轴突生长延伸、维护突触稳定性、减少或阻滞MAPK通路的激活以减少内皮损害和血压升高、改善内皮功能障碍以及与调整神经系统自身免疫性损伤有关。
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