龙眼体胚成熟过程的蛋白质组学研究

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本研究以龙眼(Dimocarpus longan Lour. cv. Honghezi)“红核子”胚性愈伤组织(Em- bryogenic callus, EC)经过体胚发生同步化调控得到的龙眼LC2玻璃化子叶胚为材料,进行如下研究:①不同浓度的蔗糖和聚乙二醇对龙眼子叶胚成熟的影响;②龙眼子叶胚正常成熟过程的蛋白质双向电泳分析;③龙眼体胚成熟过程相关蛋白的质谱鉴定及其功能分析。主要研究结果如下:1.不同浓度的蔗糖和聚乙二醇处理的龙眼子叶胚成熟效果在初始状态的早期玻璃化子叶形体胚体积、重量一致的情况下,龙眼体胚经历正常的高糖成熟体胚增大明显,鲜重增加量是所有成熟处理中最大的,体胚坚实呈乳白色;低糖培养基上龙眼子叶形体胚增重最少,但是增大效果明显,体胚较为坚实,黄褐色,少数严重褐变;体胚在添加7.5 %的聚乙二醇和20 g·L-1的蔗糖的MS培养基中成熟增重增大明显,可以比较明显的抑制体胚褐化,但是色泽方面未达到在高糖成熟条件下的乳白色的半透明状态,但是成熟效果好于其它浓度的PEG + MS培养基(0 %、2.5 %、5.0 %和10.0 %)。总之,高糖正常成熟效果最佳,添加7.5 %的聚乙二醇的MS成熟培养效果次之,其它浓度的PEG + MS培养基成熟效果较差,低糖且没有附加PEG的培养效果最差。2.龙眼体胚正常成熟过程中总蛋白点数目变化使用线性IPG胶条(pH 4-7)在Ettan IPGphorⅢ(GE Healthcare)进行第一向等电聚焦,第二向SDS-PAGE采用SE 600 Rube标准垂直电泳系统(GE Healthcare),银染法染色后凝胶采用Imagine ScannerⅢ(GE Healthcare)扫描仪采集图像,在Image Master 2D Platinum 6.0软件(GE Healthcare)做图像分析。结果表明:龙眼体胚成熟过程中总蛋白点数目变化趋势为先稍稍下降,又迅速升高,30 d升高至最高点,然后经历一个迅速降低的过程,并且蛋白点数目降低至最低值,然后体胚细胞中蛋白点总数先是几乎没有变化,后较为迅速升高,即体胚成熟培养的15 d-30 d期间,龙眼子叶形体胚蛋白点数目变化最为剧烈,经历了先迅速升高后迅速降低的过程。3.龙眼体胚正常成熟过程中总蛋白点等电点(pI)变化pI值在4-5范围内的蛋白点比例变化呈现先上升再下降趋势,然后保持几乎保持稳定;而pI值在6-7范围内的蛋白点所占比例先是缓慢升高,后较为迅速的升高,然后较为快速的降低,然后再升高最后在体胚成熟末期又降低,总的变化趋势类似“M”状;在龙眼子叶形体胚成熟晚期(75 d)此等电点的蛋白比例升至最高水平;pI值在5-6范围内的蛋白点比例经历先降低,后缓慢升高,然后在高糖成熟培养的30 d后开始迅速升高,在45 d达到最高点,此后又降低,然后升高,总的变化趋势类似“W”。4.龙眼体胚正常成熟过程中总蛋白点分子量(MW)变化龙眼早期玻璃化体细胞胚胎经历正常高糖成熟过程中,不同分子量的蛋白点变化总体趋势基本类似,呈现先上升后下降再上升的趋势,峰值都位于30 d;分子量(MW) 30 KD-45 KD的蛋白点比例在每个阶段都是最高的,居于第二位是分子量45 KD-60 KD范围内的蛋白点,居于第三位的是分子量20.1KD-30KD范围内的蛋白点,居于倒数第二位的是MW范围在14.4 KD-20.1 KD内的小分子量蛋白点,比例最低的类群是分子量66 KD-97 KD范围内的大分子量蛋白点,30 KD- 45 KD、45 KD- 66 KD、20.1 KD-30 KD、14.4 KD-20.1 KD和66 KD-97 KD的蛋白点比例峰值分别出现在45d、15d、0d、75d和0d。5.龙眼体胚正常成熟过程中15KD以下小分子量蛋白点数目变化龙眼子叶形体细胞胚胎成熟过程中,小分子量蛋白数目先略有降低再大幅升高,后持续降低,至成熟胚萌发前又略有升高的趋势,但是小分子量蛋白点比例与小分子量蛋白数目变化趋势不同,而是呈现呈先略有降低再略有升高,后持续降低的趋势,但是体胚成熟30 d时期无论小分子量蛋白数目和比例都最高(35个,2.87 %) ,小分子量蛋白在此时积累达到顶峰。6.龙眼体胚成熟过程相关蛋白表达变化龙眼子叶形体细胞胚胎成熟培养的0 d -15 d阶段,过氧化物酶(C16、C17、C19)和S-腺苷甲硫氨酸:2-去甲基萘醌甲基转移酶(C33)显著下调表达,磷酸丙糖异构酶(C22)、60 S酸性核糖体蛋白(C28)、17KD-HSP (C37)和Thi1蛋白链A (C10)显著上调表达,15 d-30 d阶段,过氧化物酶C16、C 17、C19和烯醇酶(C20)显著上调表达,17 KD-HSP (C37)、磷酸丙糖异构酶(C22)显著下调表达,30 d-45 d阶段,尿嘧啶磷酸核糖转移酶(C3)、磷酸丙糖异构酶(C23)、17 KD-HSP (C37)显著上调表达,60S酸性核糖体蛋白(C 28)显著下调表达;45 d-60 d阶段,烯酯酰-AC-还原酶(C18)显著上调表达,过氧化物酶(C15)和磷酸丙糖异构酶(C23)显著下调表达;60d-75d阶段,真核生物翻译起始因子5A (C34)显著上调表达,尿嘧啶磷酸核糖转移酶(C3)、过氧化物酶(C16)、ACP还原酶(18)显著下调表达。7.龙眼体胚成熟过程中相关蛋白的功能分析肽质量指纹图谱和串联质谱联用( combined MALDI-TOF-MS + MS/MS),成功鉴定了29个龙眼体胚成熟相关蛋白,其中除24.14 %功能未知的蛋白外,13.79 %蛋白和蛋白质合成相关,13.79 %蛋白涉及能量和糖类代谢,20.69 %蛋白涉及胁迫应答和抗氧化,3.45 %涉及氨基酸代谢,3.45 %蛋白涉及信号转导,3.45 %是结构蛋白,涉及细胞骨架的重构和辅助转运,6.90 %参与维生素代谢,6.90 %的蛋白参与核酸代谢。
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