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背景及目的:阿霉素对肿瘤具有良好的抑制作用,但在临床应用的过程中,其心脏毒副作用的出现使其疗效大打折扣。到目前为止,仅右丙亚胺被批准可以作为预防阿霉素心毒性的药物而应用于临床,但右丙亚胺也仅限于尚未出现心功能障碍患者的预防应用,对于阿霉素应用后引起心肌功能障碍的患者,目前尚未有明确的药物可以对其进行有效控制。鉴于此,寻找可以有效抑制阿霉素心毒性的药物成为肿瘤科乃至心内科医生的重要目标。氯化铵价格优廉,易于获取,并且作为一种调节机体酸碱度的离子盐对生物体各项功能活动都有极其重要的作用,故本实验欲探究氯化铵水溶液是否可以抑制阿霉素引起的心肌功能障碍。方法:将8周龄C57/BL6雄性小鼠(N=32)随机分为4组:空白对照组(喂养经过高压的三蒸水同时用生理盐水对小鼠进行腹腔注射,N=8),氯化铵组(喂养溶于高压过的三蒸水的氯化铵溶液同时腹腔注射生理盐水,N=8),阿霉素组(喂养经过高压的三蒸水同时用阿霉素溶液对小鼠进行腹腔注射,N=8),阿霉素+氯化铵组(喂养溶于高压过的三蒸水的氯化铵溶液同时用阿霉素溶液对小鼠进行腹腔注射,N=8)。每周对小鼠进行一次腹腔,连续注射两周,注射剂量按照阿霉素5mg/kg,生理盐水按照相应体重计算也为5mg/kg。同时氯化铵以0.2M的浓度于第一次注射阿霉素前一周开始对小鼠进行喂养。在小鼠最后一周腹腔注射阿霉素与生理盐水后,间息一周,应用三溴乙醇对小鼠进行麻醉后,用高分辨率动物超声影像系统对小鼠心功能进行检测、评定并于超声后麻醉状态下取材,进行如下研究:一、病理染色:使用H&E染色及Masson染色法检测心肌组织炎症、心肌肥厚程度及纤维化水平,WGA(Wheat germ agglutinin,WGA)染色比较各组心肌细胞肥大情况,Mac-2免疫组织化学染色进一步检测小鼠心肌细胞的炎症水平。二、投射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM):应用此技术对各组心肌细胞自噬水平进行检测。三、TUNEL法:细胞的凋亡水平可以通过此方法进行定量分析。四、caspse3酶活性测定:通过对相关凋亡蛋白的活性检测可以检测心肌组织的凋亡水平,进而对阿霉素引起的心肌损害进行评估。五、蛋白质印记(Western bloting,WB):P38MAPK通路相关蛋:rabbit anti-P38MAPK(diluted1:1,000,Cell Signaling Technologies),anti-p-p38MAPK(diluted 1:1,000,Cell Signaling Technology),anti-HSP27(diluted 1:1,000,R&D system),anti-p-HSP27(diluted 1:1,000,R&D system),凋亡相关蛋白:anti-BCL-2(diluted 1:1,000,Abcam),anti-BAX(diluted 1:1,000,Abcam),自噬相关蛋白:anti-Becline1(diluted 1:1,000,Abcam)内参蛋白:Gapdh antibody(diluted 1:1,000,sigma)。六、实时定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,q-PCR):炎症相关RNA:IL-1β,Interleukin-1β;心功能相关RNA:ANP,atrial natriuretic peptide;BNP,brain natriuretic peptide;内参:GAPDH,glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.结果:一、心功能评估(一)小鼠心脏超声的相关结果显示,与对照组小鼠相比,腹腔注射过阿霉素后,小鼠的心功能发生了明显的恶化,EF值明显下降。与阿霉素组小鼠相比,氯化铵+阿霉素组的小鼠心肌EF值水平得到了明显地改善(P<0.05)。(二)q PCR结果显示:对照组小鼠相比,腹腔注射过阿霉素后,小鼠心肌组织内心衰标记物ANP、BNP的水平均显著增加(P<0.05),在使用氯化铵喂养后,ANP、BNP的水平发生了明显地降低。二、心室肥厚程度(一)小鼠心脏超声结果显示:腹腔注射过阿霉素后,小鼠心脏左室内径增宽,体积增大,心室壁变薄;而使用氯化铵后,与阿霉素组相比小鼠心脏体积减小,室壁相对正常,心腔扩大不明显。(二)WGA染色结果显示:与应用生理盐水的小鼠相比,腹腔注射阿霉素的小鼠心肌细胞横截面积增大更加的明显,谁饲氯化铵后,小鼠心肌细胞的横截面积明显下降,并接近于对照组小鼠心肌细胞的横截面积。(P<0.05)三、心肌组织的炎症及相关纤维化水平(一)炎症水平1.H&E染色显示:注射生理盐水的小鼠心肌细胞大小适宜,心肌纤维排列整齐,心肌细胞间质内未出现阿霉素诱导的特异性凋亡的心肌细胞。腹腔注射阿霉素后,小鼠心肌细胞的结构混乱,细胞间隙变宽,细胞间质内出现大量形态异常的凋亡细胞。相较于阿霉素组,水饲氯化铵后,小鼠心肌组织排列相对整齐,间质变窄,细胞凋亡情况明显减轻。2.免疫组织化学方法检测炎症相关因子Mac2的表达,相关结果显示,应用阿霉素后,Mac2的表达明显升高并呈现聚集态,而氯化铵治疗以后,Mac2的表达有所改善(P<0.05)。3.q PCR结果显示:与对照组相比,阿霉素组小鼠IL-1β水平显著增高,使用氯化铵后,IL-1β水平得到改善(P<0.05)。(二)纤维化水平Masson染色结果显示:与对照组相比,阿霉素组小鼠心肌细胞间质出现严重纤维化,相对集中在心内膜乳头肌水平,而水饲氯化铵溶液后,心肌细胞纤维化的面积明显降低(P<0.05)。四、心脏细胞凋亡及自噬水平(一)TUNEL法检测细胞凋亡水平TUNEL法实验结果:与注射生理盐水的小鼠相比,腹腔注射阿霉素后,小鼠心肌细胞凋亡水平显著升高;在应用氯化铵水溶液对相关小鼠进行治疗后,小鼠心肌细胞凋亡水平发生了明显的下降(P<0.05)。(二)检测CASPSE3酶活性CASPASE3酶活性检测结果显示:与注射生理盐水的小鼠相比,腹腔注射阿霉素后,小鼠心肌细胞caspase3酶活性显著升高,在应用氯化铵水溶液对相关小鼠进行治疗后,心肌细胞内caspase3酶活性相比阿霉素组小鼠显著降低(P<0.05)。(三)应用投射电子显微镜技术对小鼠心肌细胞自噬水平进行检测电子显微镜结果显示:与对照组相比,阿霉素组小鼠自噬水平增高,自噬泡表达增多,应用氯化铵饲养后,心肌细胞自噬泡表达下降,自噬水平降低。(四)WB法对凋亡相关蛋白含量的检测Western bloting结果显示:与注射生理盐水的对照组小鼠相比,对小鼠进行阿霉素腹腔注射后,小鼠心肌细胞凋亡相关蛋白:BAX增加,BCL2降低,而应用氯化铵饲养后,与阿霉素组小鼠相比,小鼠心肌细胞BAX水平下降同时BCL2水平增高。(P<0.05)。五、WB技术检测氯化铵具体作用通路应用WB技术,进一步探究氯化铵对阿霉素引起的心肌细胞的保护作用,并探究P38MAPK在此过程中的应用(P<0.05).结论:一、氯化铵可以减弱阿霉素引起的心肌毒性,包括减弱心衰水平,EF值,纤维化程度,凋亡水平。二、氯化铵可以通过P38MAPK途径对阿霉素引起的心肌毒性起保护作用。