SlbHLH59调控番茄抗坏血酸积累的机制研究

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番茄(Solanum lycopersicum)是一种重要的园艺作物,它不但是一种广受大众喜爱的果蔬,而且是植物科学研究的重要模式植物。抗坏血酸作为一种良好的电子供体,参与着生命体多种氧化还原反应,如清除自由基等。在高等植物中,抗坏血酸生物合成的结构基因基本被克隆,但对植物抗坏血酸的合成调控及其响应环境的分子机制还了解甚少。本研究基于实验室全基因组关联分析(GWAS)得到的与抗坏血酸含量显著相关的候选基因SlbHLH59进行基因序列分析和转基因功能验证,并通过基因的表达分析、酵母单杂和双荧光素酶等实验来探究SlbHLH59对番茄抗坏血酸积累的调控机制。主要研究结果如下:1.结合300多份重测序番茄材料中SlbHLH59的10个SNP将SlbHLH59分成4种单倍型,并对这4种单倍型进行抗坏血酸含量分析,发现单倍型Ⅳ抗坏血酸含量显著高于其余单倍型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。通过一代测序进一步发现高抗坏血酸单倍型启动子区域有8 bp的插入,并导致启动子区域增加一个5 UTR Py-rich stretch顺式元件;2.通过对SlbHLH59在番茄抗坏血酸极端材料的相对基因表达测定发现SlbHLH59在高抗坏血酸材料中的表达普遍高于在低抗坏血酸材料中的表达,并且在不同组织中也呈现类似的规律;3.根据编码区A和G的碱基差异,将SlbHLH59分成SlbHLH59A和SlbHLH59G,通过亚细胞定位实验发现SlbHLH59A和SlbHLH59G均能定位在细胞核中,符合一般转录因子的核定位特性;4.对SlbHLH59的超量表达和干涉表达材料进行抗坏血酸含量测定,发现SlbHLH59能够正向调控番茄抗坏血酸的积累。超量表达SlbHLH59A和SlbHLH59G均能够显著提高番茄果实的抗坏血酸含量;5.利用MV(甲基紫精)模拟氧化逆境,发现外源喷施MV(75μmol/L)7 d后SlbHLH59超表达植株叶片坏死黄斑明显少于对照材料,DAB(二氨基联苯胺)染色发现SlbHLH59超表达材料H2O2积累显著少于对照,说明超量表达SlbHLH59能够提高番茄对氧化胁迫的应对能力;6.在SlbHLH59超表达材料和对照材料的红熟果c DNA中测定抗坏血酸合成代谢途径基因的相对表达量,发现抗坏血酸的合成基因PMI、PMM、GMP1、GMP2、GMP3、GMP4、GME1在超量表达材料中的表达明显高于对照,说明SlbHLH59能够正向调控D-甘露糖/L-半乳糖途径基因的表达;7.启动子顺式元件分析发现抗坏血酸合成基因启动子有多个b HLH结合元件E-box,酵母单杂实验证明SlbHLH59能够直接结合PMM、GMP2和GMP3的启动子;8.双荧光素酶实验表明SlbHLH59能够结合GMP2和GMP3的启动子,并正向调控GMP2、GMP3的表达;9.基因的共表达结果显示SlbHLH59与GMP2在番茄的不同组织和不同果实发育时期的表达有较高的一致性。
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