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脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)以谷胱甘肽(GSH)为底物将脱氢抗坏血酸(DHA)还原为抗坏血酸。DHAR基因在植物抗逆反应中发挥着重要作用。为揭示植物体内不同拷贝DHAR基因的功能差异,以及DHAR蛋白与GSH结合位点(G位点)氨基酸的催化性质,本文从毛白杨中克隆了3个DHAR基因(PtoDHAR1、PtoDHAR2、 PtoDHAR3),研究它们在毛白杨中的表达模式、蛋白质结构与功能,并利用定点突变方法研究了DHAR蛋白的G位点氨基酸的催化特征。主要结果如下：1.我们从毛白杨中克隆到3个DHAR基因,分别命名为PtoDHAR1、PtoDHAR2和PtoDHAR3。这3个DHAR基因分别编码270、212和212氨基酸的蛋白质,预测分子量分别为30.0kDa、23.63kDa和23.43kDa。蛋白质保守结构域分析、多序列比对、三维结构模拟等数据确定这3个DHAR蛋白属于DHAR基因家族。2.半定量RT-PCR实验发现,3个毛白杨DHAR基因在正常生长下不同组织(茎、叶、韧皮部和根)中均表达,但是PtoDHAR1在叶子和韧皮部的表达水平显著高于在根和茎组织。将3个毛白杨DHAR蛋白与绿色荧光蛋白连接,并在拟南芥原生质体中瞬时表达重组蛋白,发现PtoDHAR1定位于叶绿体,而PtoDHAR2和PtoDHAR3定位于细胞质。因此基因的表达模式和亚细胞定位研究说明毛白杨DHAR基因存在功能的分化。3.将3个毛白杨DHAR蛋白在大肠杆菌中进行表达,并对所表达的蛋白进行纯化。纯化后的蛋白经质谱和分子筛凝胶层析分析发现,这3个蛋白均为单体,仅由一个亚基组成。酶学性质分析发现3个DHAR蛋白仅对底物DHA有催化活性,活性分别为53.02、49.89和38.32μmol/min/mg。3个DHAR蛋白对DHA的催化活性有一个较广泛的温度和PH适应范围,在55℃时它们均能保留各自最大活性50%以上,在PH值等于6.5～8.5时能保留40%以上的最大活性。在3个DHAR蛋白中,PtoDHAR2对底物GSH表现出最高的亲和力。4.通过序列和结构的比较,我们预测PtoDHAR2蛋白的Lys8、Cys20、Pro61、Asp72和Ser73可能是G位点氨基酸。通过定点突变将这些预测的G位点氨基酸分别突变为Ala,发现这5个位点均影响了DHAR蛋白的催化活性。而利用ANS荧光探针检测蛋白质疏水表面,发现Cys20、Pro61和Asp72三个氨基酸影响了PtoDHAR2蛋白的三维结构。因此基于蛋白生化性质和结构分析预示着这个5个氨基酸殘基对DHAR蛋白的催化性质和三维结构有重要的影响。