HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-related acute-on-chronic liver failure,HBV-ACLF）是我国及亚太地区慢性肝病患者常见的危急重症,临床上表现为短期内出现高胆红素血症、凝血酶原时间延长（INR≥1.5）,起病迅速,病死率高,缺乏特异治疗手段。目前认为HBV-ACLF的发生主要与宿主遗传因素、病毒以及宿主免疫相互作用有关,但是其确切的发病机制尚不明确。近年来,西方基于酒精性肝硬化的ACLF的研究报道较多,认为酒精性肝硬化相关ACLF患者从急性发作、炎症损伤、免疫失调到系统性炎症反应综合征（systematic inflammatory response syndrome,SIRS）、代偿性抗炎反应综合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome,CARS）、再生反应等多环节事件的幅度和次序,决定着患者是炎症消退-康复还是进展到肝外器官衰竭,系统性炎症反应是酒精性肝硬化患者发生ACLF的主要驱动因素。慢性HBV感染者是否发生肝炎发作,发作后是否进展为肝衰竭,由于HBV缺乏慢性感染的动物模型,且ACLF的病因和诱因存在很大的异质性,目前对HBV相关ACLF的肝脏免疫学应答及免疫病理过程仍然知之甚少。既往针对HBV病毒序列变异的研究认为C基因启动子区、前C区和C区变异与乙型肝炎的发作及暴发性肝衰竭相关。但是,同样的前C、C区变异既可以见于不同的病变表型（普通乙型肝炎、肝硬化、肝癌）,也可见于无症状携带者。事实上,病毒变异是否导致乙型肝炎重症化的发生和发展,受到宿主因素的制约。乙型肝炎的发生、发展和转归,是病毒（病毒载量、变异、进化）和宿主（遗传异质性、年龄、性别等）通过免疫应答相互作用导致的常见复杂疾病。常见复杂疾病（common complex diseases）通常由许多微效累加基因与环境因素共同作用而决定的。HBV-ACLF的发生、发展,涉及到免疫识别、炎症活化/放大、肝细胞坏死、SIRS、CARS、器官衰竭等多个环节,也属于常见复杂疾病的范畴,其遗传因素也涉及多个微效基因的作用。在复杂疾病遗传易感性研究中,关联研究-连锁不平衡分析方法最为常用,统计效能也远高于家系连锁分析。基于全基因组策略的遗传关联研究,是目前复杂疾病遗传关联研究的主流,与候选基因策略相比其优点在于统计效能有着极大的提高,同时可以避免群体分层偏倚和基因选择的偶然性,可以从全基因组角度获得复杂疾病遗传特征的全局、系统的认识。开展HBV-ACLF表型的全基因组关联研究（genome-wide association study,GWAS）,解析其全基因组范围内的宿主遗传位点及遗传关联图谱,有助于认识HBV-ACLF的驱动机制及干预靶点。因此,本课题在建立HBV-ACLF病例大样本、多中心队列的基础上,对其临床特征及炎症因子谱进行了分析,开展了HBV-ACLF的全基因组关联研究,并对主要关联位点HLA-DR进行了精细解析和功能注释,以及阳性关联HLA等位对HBV变异的限制性分析。本研究结果首次从全基因组角度明确了HBV-ACLF的主要遗传位点,提示HLA-DR等位限制性CD4+T细胞途径对HBV-ACLF的驱动作用。本课题的主要研究结果如下:1.共纳入1300例HBV-ACLF患者和2087例HBV无症状携带者进入3-stage的全基因组关联研究,样本来自重庆、北京、泉州、遵义、南宁5个中心。所有患者均无抗病毒史、无既往肝炎发作或肝功能失代偿病史。对1300例HBV-ACLF患者进行临床特征分析,LC-ACLF占60%左右,NLC-ACLF占40%;HBe Ag阴性的HBV-ACLF占60%,HBe Ag阴性并且HBV DNA<104 IU/m L的HBV-ACLF占17.1%。与LC-ACLF相比,NLC-ACLF患者表现为更年轻（平均年龄39.5 vs.43.9岁,p=3.14×10-11）、更高的ALT水平（平均值1153 vs.809 IU/L,p=1.36×10-11）、腹水阳性率较低(58.7%vs.88.4%,p=9.25×10^-35)、起病后更短时间内INR达到1.5及发生脑病（平均值分别19.8vs.24.8天,p=1.36×10-11;27.3 vs.38.1天,p=5.16×10-6）。2.对1013份患者血清样本进行35种细胞因子的多重定量检测,结果显示,国外酒精性肝硬化ACLF研究所关注的重要指标PCT（提示细菌感染）和CRP（提示肝外器官衰竭）,在我们HBV-ACLF患者中其浓度低于普通慢性乙型肝炎（CHB）患者。与慢性乙型肝炎轻中度及重度相比,HBV-ACLF患者显著升高的细胞因子有6种:Th1型细胞因子IL-1a、TNF-β,Th2型细胞因子IL-5、IL-10和IL-13,Th17型细胞因子IL-17。3.HBV-ACLF的GWAS初始阶段分析显示全基因组范围内1、6、12号染色体有显著的关联信号（p<1×10-5）,LC-ACLF和NLC-ACLF两种亚型的共同遗传关联位点位于6号染色体HLA-II区域。经过replication 1a和1b独立样本验证表明HLA-DR区域是主要关联位点,再经过replication 2a和2b验证,明确了rs3129859与HBV-ACLF显著相关（P combine=7.40×10-19,OR=1.83）。4.分层分析显示rs3129859是HBV-ACLF的独立风险因素,与慢性乙型肝炎活动状态和HBV再活化无关。风险等位rs3129859*C与HBV-ACLF临床进程相关,携带风险等位rs3129859*C的ACLF患者和S-CHB患者,在入院28天时INR达到1.5及发生腹水的风险更高（分别有p=3.95×10-4,p=3.03×10-4）。在NLC-ACLF亚组,携带风险等位rs3129859*C的患者,28天死亡率更高（p=0.03）。5.HLA-DRB1*1202等位是HBV-ACLF最显著的风险等位（p=3.94×10-6,OR=2.05）。HLA-DRB1*1202的全球分布与HBV-ACLF地理流行病学趋势一致,在中国（5.9-21.7%）和东南亚地区（6.8-35.3%）等位频率最高。6.HLA-DRβ第28位氨基酸是最显著的关联氨基酸（p=3.03×10-6,OR=1.75）。其次,关联的氨基酸还包括HLA-DRβ蛋白第26、30、32、37、38和85位氨基酸,以及HLA-DQα蛋白第40、47、50、51、53、56、69、76位氨基酸和HLA-DQβ蛋白第45位氨基酸（p<0.001）。蛋白结构三维重建显示这些关联氨基酸位于HLA分子抗原结合沟槽内。7.等位单倍型rs3129859C-DRB1*1202-DQA1*0601-DQB1*0301和氨基酸单倍型DRβ-LEHHLLA-DQα-GCVLQdel TL-DQβ-E是风险单倍型,携带风险单倍型的HBV感染者,罹患ACLF的风险更高（additive model,分别p=1.16×10-4,OR=1.94;p=2.43×10-6,OR=2.10）。8.生存分析提示风险等位及风险单倍型与HBV-ACLF临床进程相关。在非肝硬化ACLF亚组,携带风险单倍型rs3129859C-DRB1*1202-DQA1*0601-DQB1*0301的患者入院后28天（p=3.49×10-4）、90天（p=0.003）及180天（p=0.003）的死亡率更高,且肝性脑病发生率更高（p=0.019）,氨基酸单倍型也观察到一致的相关性。9.HBV-ACLF关联位点功能注释:e QTL分析显示关联位点rs3129859与HLA-II基因表达相关;GRAIL文献分析显示HLA-DR和HLA-DQ是最合理的关联基因。与其他HBV相关GWAS文献overlap分析,显示HBV-ACLF的遗传关联位点与慢性HBV感染的遗传关联位点有部分重叠。10.通过分析HLA-DRB1*1202风险等位对HBV变异的限制作用,鉴定出12个HBV变异,既表现出HBV-ACLF风险等位HLA-DRB1*1202特异性和肝炎活化特异性,同时也是病毒发生正选择的热点氨基酸位置。表位预测分析发现,这些变异可引发病毒表位漂移。结论:1.我们的数据对于认识HBV-ACLF的自然史有重要意义:相当比例的慢性HBV感染者可在无肝硬化基础的情况下发生ACLF;HBV自然史处于低复制期和e抗原阴性期的患者,发生ACLF的风险不容忽视;NLC-ACLF的疾病进展更为迅速,HBV-ACLF发病年龄（42岁）远低于欧洲酒精性肝硬化ACLF患者（56岁）。2.HBV-ACLF患者血清炎症因子谱分析表明HBV-ACLF患者确实存在剧烈的SIRS和CARS并存局面。HBV-ACLF患者CD4 Th细胞因子通路剧烈活化,有别于慢性乙型肝炎轻中度和重度,也不同于欧洲酒精性肝硬化ACLF患者。3.NLC-ACLF和LC-ACLF亚型具有共同的遗传易感位点,亚型位点、定量性状位点（肝酶、性激素等）与HBV-ACLF位点通路存在交互作用。4.HLA-DR是HBV-ACLF的主要遗传易感位点,风险等位rs3129859*C和HLA-DRB1*1202可作为HBV-ACLF临床预警预后的marker。风险等位有特异限制的病毒变异位点,与肝炎活化、病毒正选择和表位漂移有关。总之,本研究首次在HBV相关慢加急性肝衰竭患者中开展了全基因组关联研究,从全基因组范围内鉴定出HLA-DR是HBV-ACLF的主要关联位点,且关联的风险等位和单倍型与HBV-ACLF临床进程显著相关,提示了HLA-II类分子限制的CD4+T细胞途径在HBV-ACLF的免疫病理过程中的重要作用,同时也表明肝硬化和非肝硬化基础的HBV-ACLF为同质性疾病,支持一个疾病的假说（one disease hypothesis）。