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丝素蛋白是一种源于蚕丝的纤维蛋白,由于其优良的理化性质和生物相容性,丝素蛋白纤维除了应用于传统的纺织领域外,人们越来越多地关注其在生物医学材料领域的应用。本研究利用基因重组技术把含有短肽RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)的序列连接到桑蚕丝素蛋白的结晶序列GAGAGS上,形成具有[TGRGDSPA(GVPGV)2GG(GAGAGS)3AS]n(简称为Silk-RGD)一级结构的桑蚕丝素-RGD融合蛋白质,以期源于桑蚕丝素蛋白的序列在经过材料的加工成型后形成结构区,主要提供材料的力学性能,而含短肽RGD的序列形成功能区,主要提供材料的细胞粘附性能。利用重组技术和发酵技术,我们成功地合成了具有分子量38kDa的重组类丝状Silk-RGD(8)融合蛋白。细胞粘附性分析结果显示,融合蛋白对小鼠成纤维细胞BALB/3T3的增殖性能与天然胶原蛋白相近,且表现出了比胶原蛋白更好的细胞粘附性能。为了能够获得大量具有一定纯度的融合蛋白原料,克服亲和层析速度慢、成本高的缺点,本研究根据Silk-RGD融合蛋白的特点,探索一种简便、经济、快速的硫酸铵盐析法提纯工艺。研究发现,Silk-RGD(8)融合蛋白的等电点为pH8,相对合理而且易操作的盐析纯化条件为:pH8,硫酸铵在溶液中的饱和度为20﹪,室温(约20℃)。在此盐析条件下获得的重组类丝状蛋白的纯度约为70﹪,每升培养基可获得重组蛋白湿重为8.4 g左右。为了探索该重组蛋白可能的应用领域,本研究首先以天然丝素蛋白为原料进行了多孔支架材料的研制。在丝素蛋白溶液中添加有机溶剂,并结合冻干法制备了多孔支架材料,通过对其溶胀性、孔隙率、压缩强度、压缩模量以及二级结构转变和表面构造的分析发现,丝素支架材料可以达到80﹪以上的孔隙率,孔与孔之间贯通性较好,支架材料拥有较好的压缩强度以及压缩弹性。
本研究利用基因重组技术合成了功能性类丝状蛋白质材料,通过对其盐析工艺条件的探索,为其大量制备提供了保证。同时,以天然丝素蛋白为模板,研究了多孔支架材料的制备方法,从而为进一步利用重组类丝状蛋白来开发和制备多孔支架材料提供了一定的依据。