研究背景:本课题组以往研究发现,严重烧伤早期即可发生心肌缺血,导致心肌缺血缺氧损伤（休克心）。在我们前期研究中,细胞实验结果提示,CD38蛋白表达量明显增加,同时伴有自噬通量的增加以及自噬流的损伤。但CD38高表达和自噬流受损对缺血缺氧心脏产生何种病理影响及CD38高表达和自噬流之间的关系尚不明确。因此,探讨CD38高表达和自噬流状态的病理生理意义,可以深入了解烧伤等缺血缺氧性心肌损伤的具体发病机制,为临床的预防和有效治疗提供新的靶点。CD38是一种广泛存在于全身多脏器的蛋白,具有降解烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD）的酶活性。应激损伤条件下,NAD的大量降解可导致细胞代谢障碍,继而引起能量不足及活性氧产物增加,这些改变会诱导自噬过程的发生;在不同的病理生理条件下NAD可以通过转录调控作用影响自噬流相关的多种基因的表达,从而参与调控自噬流的各个阶段。自噬流分为自噬诱导、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合及自噬溶酶体降解四个阶段,任何一个阶段发生障碍都会影响自噬的功能,甚至会诱导细胞发生自噬性凋亡。多种病理损伤都会诱导心肌细胞内自噬发生,完整的自噬过程可以为细胞提供更多的能量,降解有害的蛋白及受损的细胞器,是应激条件下保证细胞存活的关键机制。严重烧伤等心肌缺血缺氧条件下,高表达的CD38是否通过降解NAD介导了自噬流改变,CD38高表达对自噬过程的哪一阶段产生了影响,CD38影响自噬流的具体分子机制,以及CD38是否通过自噬流介导严重烧伤及其它原因导致的缺血缺氧心肌损伤,均有待进一步研究。本研究通过检测法洛四联症患者缺血缺氧心肌组织、严重烧伤缺血缺氧心肌组织、心肌梗死动物缺血缺氧心肌组织、体外培养的缺血缺氧心肌细胞中CD38表达量的改变,了解其在多种心肌缺血缺氧模型中的变化规律;继而通过构建CD38基因敲除小鼠反向调控CD38表达水平,在体探索CD38对缺血缺氧心肌自噬流及心功能的影响,旨在深入揭示烧伤等心肌缺血缺氧条件下,CD38、自噬流及心肌损伤三者间的关系及调控机制,找到有效的临床防治靶点。材料和方法:1.从陆军军医大学第二附属医院心外科收集16例经手术切取的法洛式四联症（tetralogy of fallot,TOF）患者肥厚的右心室心肌组织标本（约150 mg）,并按患者入院时氧合指数（oxygenation index,OI）分为两组（OI≤240和OI≥300,各8例）;制备心肌梗塞（myocardial infarction,MI）和25%全层皮肤（25%of the total body surface area,25%TBSA）烧伤小鼠动物模型,分别获得其左心室心肌标本;构建小鼠原代心肌细胞缺血缺氧模型,通过免疫印迹,实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）及免疫荧光技术对所获得的三种心肌病理标本及小鼠原代心肌细胞进行检测,了解CD38蛋白水平及转录水平在不同类型心脏疾病中的变化情况。2.CD38基因敲除小鼠由美国罗彻斯特大学Frances E.Lund教授赠送,CD38^-/-小鼠编号为B2.129P2-CD38tm1Lnd。通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术鉴定小鼠基因型,鉴定方案根据美国罗彻斯特大学Frances E.Lund教授课题组提供的说明书进行。分别对烧伤前后的8周龄的野生型（wild type,WT）小鼠和CD38 KO小鼠进行观察检测,通过超声心动图、磷酸激酶（CK-MB）试剂盒、肌钙蛋白T（cTnT）试剂盒、原位末端凋亡法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL）试剂盒、透射电镜、免疫组化等多种方法了解严重烧伤及单纯缺血缺氧条件下,高表达CD38对心脏/心肌细胞的功能和病理变化的影响。同时,通过构建CD38高表达腺病毒,转染并回调CD38 KO小鼠原代心肌细胞中CD38蛋白水平,缺血缺氧处理12小时后,利用乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase,LDH）试剂盒、细胞活性（Cell Counting Kit 8,CCK-8）试剂盒、TUNEL试剂盒离体检测缺血缺氧诱导的心肌细胞损伤程度,进一步明确CD38在严重烧伤等缺血缺氧条件导致的心肌损伤中的作用。3.通过收集烧伤前后的WT和CD38 KO小鼠的左心室心脏组织,利用免疫印迹、免疫荧光和透射电镜技术探究烧伤后小鼠心脏中心肌细胞自噬流各阶段（自噬诱导、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合、自噬溶酶体降解）的情况。离体实验中,我们利用自噬双标腺病毒（Ad-mRFP-GFP-LC3）转染WT小鼠原代心肌细胞、CD38 KO小鼠原代心肌细胞和转染了CD38高表达腺病毒的CD38 KO小鼠原代心肌细胞,三组小鼠原代心肌细胞经缺血缺氧处理12小时后,通过免疫荧光技术检测自噬体及溶酶体融合情况,并通过免疫印迹和透射电镜技术综合检测分析自噬诱导、自噬体形成及自噬体与溶酶体的融合三个阶段,同时利用溶酶体标记染料（Lyso-Sensor/Lyso-Tacker）染色并检测溶酶体及自噬溶酶体酸化情况,以初步判断自噬溶酶体降解能力。结合在体及体外实验明确烧伤等缺血缺氧条件下CD38高表达对自噬流各个阶段的影响。4.通过腹腔注射氯喹（chloroquine,CQ）在体阻断WT及CD38 KO小鼠心脏内自噬体与溶酶体融合,利用小动物超声心动图、CK-MB试剂盒、cTn T试剂盒、TUNEL试剂盒检测对比注射氯喹前后及烫伤前后WT和CD38 KO小鼠的心肌损伤程度。此外,利用氯喹与小鼠原代心肌细胞共培养,缺血缺氧处理小鼠原代心肌细胞12小时,通过LDH试剂盒、CCK-8试剂盒、TUNEL试剂盒离体检测心肌细胞损伤情况。综合在体及离体实验明确CD38通过阻断自噬流介导烧伤等缺血缺氧条件下的心肌损伤。5.通过收集烧伤前后WT及CD38 KO小鼠的左心室心肌组织,利用信使核糖核酸微阵列（mRNA microarray）筛选检测自噬相关的差异基因,并利用免疫印迹技术检测筛选出的差异基因对应的蛋白表达情况;然后分离提纯小鼠原代心肌细胞,转染CD38高表达腺病毒,经缺血缺氧处理12小时后收集细胞,并利用RT-PCR及免疫印迹技术进一步在细胞水平明确CD38对筛选出的差异基因存在调控作用。构建差异基因的敲减及高表达腺病毒,转染小鼠原代心肌细胞,利用免疫印迹及免疫荧光技术检测干预差异基因后心肌细胞在缺血缺氧条件下自噬体及溶酶体的融合情况,并利用LDH试剂盒、CCK-8试剂盒、TUNEL试剂盒检测干预差异基因后心肌细胞在缺血缺氧条件下的损伤情况。综合以上实验以筛选明确CD38调控自噬体与溶酶体融合的关键分子。6.通过离体培养小鼠原代心肌细胞,经缺血缺氧处理12小时后收集细胞,利用免疫印迹、NAD试剂盒、Sirtuins试剂盒、Sirt1试剂盒、荧光素酶报告基因实验（Luciferase reporter assay）、染色质共沉淀-测序（Chromatin immunoprecipitation sequencing,Chip-Seq）探索CD38对筛选出的差异基因的转录调控作用,以明确烧伤等缺血缺氧条件下心肌细胞内CD38高表达阻断自噬体与溶酶体的融合的具体机制。结果:1.通过免疫印迹、免疫荧光及RT-PCR检测发现,OI≤240较OI≥300的TOF心脏标本提示,CD38的mRNA水平及蛋白水平在缺血缺氧组明显增加;在MI小鼠模型中,血管结扎180min后,CD38的mRNA水平及蛋白水平均较假手术组明显增加;在25%TBSA烧伤小鼠模型中,严重烧伤24 h后,CD38的mRNA水平及蛋白水平较未烧伤对照组明显增加;在小鼠原代心肌细胞缺血缺氧模型中,心肌细胞经缺血缺氧处理12h后,CD38的mRNA水平及蛋白水平均较常氧对照组明显增加。四组心肌缺血缺氧病理模型中均有CD38高表达。2.在完成对CD38 KO小鼠的鉴定繁殖后,我们选取同窝出生的野生型小鼠及CD38 KO小鼠进行试验。首先我们利用免疫印迹技术检测CD38 KO小鼠心肌组织中的CD38蛋白水平,CD38 KO小鼠较WT小鼠心脏的CD38表达量显著降低,提示CD38 KO小鼠培养繁殖成功。然后随机选取8周龄的WT和CD38 KO小鼠各20只制备25%TBSA严重烧伤小鼠模型,通过小动物超声心动图检测在体心功能发现,严重烧伤24 h后,CD38KO小鼠和WT小鼠的左室收缩及舒张功能均较烧伤前下降,但CD38 KO小鼠的左室收缩及舒张功能均明显优于WT小鼠;血清心肌酶谱及肌钙蛋白检测提示,严重烧伤后CD38 KO小鼠和WT小鼠均存在心肌损伤,但CD38 KO小鼠血清中CK-MB及cTnT水平均明显低于WT小鼠;凋亡检测发现,严重烧伤导致CD38 KO小鼠及WT小鼠心肌细胞凋亡率上升,但CD38 KO烧伤小鼠的心肌细胞凋亡率显著低于WT烧伤小鼠;透射电镜结果提示,严重烧伤条件下,CD38KO小鼠心肌细胞内线粒体结构明显优于WT小鼠,此外,CD38 KO小鼠和WT小鼠心肌细胞内均发现有自噬体和自噬溶酶体的存在。3.CD38 KO小鼠心肌细胞中的自噬溶酶体/自噬体的比例明显高于WT小鼠,WT小鼠心肌细胞中呈现出较多的未与溶酶体融合的自噬体。在细胞实验中,我们分别分离培养WT小鼠及CD38 KO小鼠的原代心肌细胞,并用CD38高表达腺病毒转染回调CD38KO小鼠原代心肌细胞中的CD38蛋白水平,缺血缺氧处理后,CD38 KO小鼠原代心肌细胞的LDH释放水平及凋亡率明显低于WT小鼠原代心肌细胞,CD38 KO小鼠原代心肌细胞活性明显优于WT小鼠原代心肌细胞,这种源自CD38 KO的保护效应会因回调CD38蛋白水平而消失。4.我们获得CD38 KO小鼠及WT小鼠烧伤前后的心脏组织标本进行检测,免疫印迹结果提示,严重烧伤条件下,CD38 KO小鼠及WT小鼠的自噬诱导通路mTOR/P70S6K均被抑制,AMPK/ULK均被激活,且抑制及激活程度均无统计学差异;CD38 KO小鼠心脏内LC3-II蛋白水平略低于WT小鼠,CD38 KO小鼠心脏内P62蛋白明显低于WT小鼠;免疫荧光检测发现,严重烧伤后CD38 KO小鼠自噬体与溶酶体融合情况明显优于WT小鼠,WT小鼠心脏内未与溶酶体融合的自噬体显著堆积,而CD38敲除后的这种促融合作用会被氯喹完全抑制。离体细胞实验中,通过培养WT、CD38 KO、CD38KO+Ad-CD38三种原代心肌细胞,经缺血缺氧处理后,免疫印迹及免疫荧光检测发现,CD38 KO小鼠原代心肌细胞与WT小鼠原代心肌细胞的自噬流情况均与体内实验结果一致,CD38 KO+Ad-CD38原代心肌细胞中自噬流状态与WT小鼠原代心肌细胞中相似;Lyso-Sensor和Lyso-Tracker标记溶酶体后,利用激光共聚焦显微镜观察发现,CD38 KO小鼠原代心肌细胞中溶酶体酸化程度与WT小鼠原代心肌细胞相同,无统计学差异。5.通过小动物超声心动图检测烧伤前后WT、WT+CQ、CD38 KO、CD38 KO+CQ八组小鼠发现,未烧伤的WT、WT+CQ、CD38 KO、CD38 KO+CQ四组小鼠,左室收缩及舒张功能相同,没有统计学差异;烧伤后四组小鼠心功能均较烧伤前下降,WT+CQ烧伤小鼠心功能与WT烧伤小鼠相同,无统计学差异,CD38 KO烧伤小鼠心脏收缩及舒张功能均优于WT烧伤及WT+CQ烧伤小鼠,这种改善功能在CD38 KO小鼠腹腔注射CQ后消失。CK-MB、cTnT及TUNEL检测结果趋势均与小动物超声心动图检测结果相同。6.通过对烧伤前后WT及CD38 KO小鼠心脏标本的差异基因检测发现,CD38 KO烧伤小鼠的PLEKHM1、Rab7和ATG12的mRNA水平显著高于WT烧伤小鼠;而烧伤前CD38 KO小鼠心脏中只有PLEKHM1的mRNA水平高于WT小鼠,两组小鼠的Rab7及ATG12的mRNA水平相同,没有统计学差异。免疫印迹检测发现,烧伤前后,CD38KO小鼠的PLEKHM1蛋白水平均高于WT小鼠,烧伤后增加更为明显;Rab7蛋白水平在烧伤前的CD38 KO小鼠与WT小鼠之间比较没有差异,烧伤后,WT小鼠心脏中Rab7蛋白水平明显低于烧伤前WT及CD38 KO小鼠,CD38 KO小鼠烧伤后Rab7蛋白水平保持了与烧伤前WT及CD38 KO小鼠相同的水平。烧伤后,CD38 KO及WT小鼠的ATG12的蛋白水平高于烧伤前CD38 KO及WT小鼠,而无论烧伤前后,CD38 KO小鼠与WT小鼠之间的ATG12蛋白水平不存在差异。离体细胞实验中,通过CD38高表达腺病毒转染CD38 KO小鼠原代心肌细胞,缺血缺氧处理后,经RT-PCR及免疫印迹检测发现,PLEKHM1、Rab7和ATG12三种分子的mRNA及蛋白水平在CD38 KO小鼠原代心肌细胞与WT小鼠原代心肌细胞的比较中,趋势与在体实验相同,转染了CD38高表达腺病毒的CD38 KO小鼠原代心肌细胞中这三种分子的mRNA及蛋白水平的变化趋势与WT小鼠原代心肌细胞相同。在细胞水平,我们利用PLEKHM1及Rab7高表达腺病毒转染WT小鼠,利用PLEKHM1及Rab7敲减腺病毒转染CD38 KO小鼠原代心肌细胞,经免疫印迹、免疫荧光及相关试剂盒检测发现,WT小鼠原代心肌细胞在缺血缺氧条件下只有同时高表达PLEKHM1及Rab7才能促进自噬体与溶酶体融合,降低细胞LDH释放水平及细胞凋亡率,改善细胞活性;CD38 KO小鼠原代心肌细胞在缺血缺氧条件下,单独敲减PLEKHM1和Rab7中任一分子即可抑制自噬体与溶酶体融合,增加细胞LDH释放水平及细胞凋亡率,抑制细胞活性。7.离体实验中,通过免疫印迹检测发现,缺血缺氧条件下CD38 KO小鼠原代心肌细胞中Rab7的蛋白水平会因NAD的下调、Sirt1的敲减、FOXO1的活性被抑制而下降,WT小鼠原代心肌细胞中Rab7的蛋白水平会因NAD的上调而增加;PLEKHM1的蛋白水平则不受NAD、Sirt1及FOXO1的影响。进一步通过免疫印迹技术研究CD38对PLEKHM1的调控作用,发现CD38在体及离体情况下均有核内表达的情况;荧光素酶报告基因结果提示,CD38分子蛋白不能与PLEKHM1基因的启动子区转录调控序列结合,Chip-Seq结果提示,CD38分子亦不与PLEKHM1基因的其他调控序列结合,但CD38可直接结合到其他转录因子的调控序列,经分析,这些可与CD38结合的基因对应的转录因子中有潜在的可与PLEKHM1转录调控序列相结合的分子。结论:无论是严重烧伤和心肌梗死心脏疾病动物模型,还是法洛四联症患者,亦或是缺血缺氧心肌细胞模型,心肌细胞中CD38蛋白水平均较对照组显著增加。缺血缺氧条件下,CD38的高表达可通过NAD依赖途径抑制Rab7的蛋白水平,同时通过非NAD依赖途径抑制PLEKHM1的蛋白水平,进而阻断自噬体与溶酶体融合,引起自噬体堆积,诱导细胞凋亡,造成心肌损伤,最终导致心脏收缩及舒张功能严重受损。以上结果可以帮助我们深入挖掘并了解缺血缺氧导致心肌损害和心功能障碍的机制,为缺血缺氧诱导的相关心脏疾病的干预和治疗提供新的靶点。