【背景】头面部颈部恶性肿瘤日益多发，手术治疗是一种主要的治疗手段，但很多患者仍需要接受放射治疗，其中主要并发症之一就是导致与癌肿位置毗邻的正常腺体组织受损，从而致使涎腺正常功能出现损害，引起口干症，黏膜慢性炎症，猛性龋齿等多种并发症。目前临床治疗技术限于对症治疗，治标难治本。近年来组织工程中干细胞治疗技术的广泛研究为涎腺组织再生提供了一条可行之路。【目的】研究脂肪来源干细胞（dipose-derived stem cells，ASCs）对放射性损伤涎腺的治疗作用。观察注射ASCs能否体内转分化为腺泡细胞，重建涎腺的分泌功能，促进涎腺再生。为ASCs复合体治疗涎腺再生提供实验基础及对照。为涎腺功能障碍和涎腺损伤的治疗提供重要的理论和实验依据。【方法】1.建立小鼠涎腺局部放射损伤动物模型：选取60只6周龄雌性C57小鼠，麻醉后下颌下腺局部照射。实验组分成5组，每组10只小鼠，直线加速器分别给予单次12Gy，15Gy，18Gy，21Gy，24Gy的下颌下腺局部照射，另设一组空白对照组，数量同为10只小鼠。SPF条件饲养，观察放射后生存情况；测体重，测血常规；放射前，放射后3月及6月测定各组小鼠唾液流量及唾液淀粉酶含量，取各组小鼠下颌下腺切片，行组织学检测，内容包括HE染色、PAS染色、透射电镜观察、细胞凋亡检测。观察放射后涎腺受损情况。测定建立小鼠涎腺局部放射损伤模型最佳剂量及干细胞体内移植的最佳时间节点。选取最佳照射剂量行小鼠下颌下腺局部照射，建立小鼠涎腺局部放射损伤动物模型。2.小鼠ASCs体外分离、培养和相关鉴定：取材动物选择2周龄雄性C57小鼠，无菌条件下手术切取腹股沟处脂肪组织，常规消化，分离及培养细胞。测生长曲线，细胞表面标志物等，体外行细胞成脂及成骨诱导并做鉴定。3.体外荧光标记小鼠ASCs，将其注射到动物模型体内进行细胞归巢示踪实验：选取两种C57小鼠ASCs，分别为普通C57小鼠及GFP转基因C57小鼠。DiI及DEPI荧光染料对普通C57小鼠ASCs行体外染色。GFP转基因C57小鼠ASCs仅体外行DEPI荧光染色，观察结果并拍照。分别将荧光标记的普通小鼠ASCs及GFP转基因C57小鼠ASCs尾静脉注射至动物模型小鼠体内。将DiI标记的小鼠ASCs直接注射到动物模型小鼠下颌下腺周围，24h后切取动物模型下颌下腺组织制成冰冻切片，DEPI荧光染料染色，荧光显微镜下观察，拍照。4.研究尾静脉及腺体局部直接皮下注射ASCs对治疗小鼠放射损伤涎腺的作用：共设5组，A：正常对照组；B：NS+尾静脉注射组；C：ASCs+尾静脉注射组；D：NS+腺体局部注射组；E：ASCs+腺体局部注射组。功能学检测：完成干细胞注射3个月后对各组小鼠的唾液流量及唾液淀粉酶含量进行测定，统计学分析。组织学检测：各组小鼠下颌下腺切片，HE染色、PAS染色、透射电镜观察、细胞凋亡检测。测定细胞凋亡指数。观察动物模型腺泡细胞再生情况。5.统计学方法：数据均采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。两两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差检验，P<0.05有统计学意义。【结果】1.成功构建小鼠涎腺局部放射损伤动物模型：局部放射剂量的大小与小鼠全身影响及下颌下腺损伤程度成正比关系。18Gy局部照射后小鼠体重及血细胞测定基本正常，但下颌下腺损伤严重，下颌下腺唾液流量及唾液淀粉酶含量分别下降66.7%及64%。HE染色及PAS染色显示腺泡数量明显减少。透射电镜观察见浆液细胞水肿变性。细胞凋亡检测显示有大量凋亡细胞，凋亡指数为24±4.1%。相比18Gy照射3月，18Gy照射6月后腺体损伤进一步加剧，小鼠唾液流量及唾液淀粉酶含量持续下降。HE染色及PAS染色显示腺泡数量进一步减少。浆液性细胞严重变性，染色质边集，胞核固缩。细胞凋亡指数51.9±3.9%，与18Gy照射3月组间比较有统计学意义（P＜0.05）。2.培养出小鼠ASCs，完成相关鉴定：细胞形态多为长梭形，呈漩涡状排列。生长曲线呈S型；流式细胞分析CD29、CD90、CD44表达阳性，CD31、CD45、CD34表达阴性；成脂及成骨分化诱导结果鉴定均为阳性。3.尾静脉及腺体局部直接皮下注射ASCs混悬液后，在小鼠放射性损伤涎腺组织中发现标记的ASCs：DiI及DEPI荧光染料染色体外对ASCs标记成功。荧光标记的普通小鼠ASCs及GFP转基因C57小鼠ASCs尾静脉注射至动物模型小鼠体内后在小鼠下颌下腺出现；涎腺组织中也发现腺体局部注射标记的ASCs。4.完成脂肪来源干细胞注射后动物模型受损涎腺组织功能学及形态学改善。①唾液流量及唾液淀粉酶含量C组及E组相较B组及D组明显增加，但较A组（正常对照组）仍低，C及E组分别与其他各组统计学比较均有差异（P＜0.05），C组与E组，B组与D组两两组间比较无统计学意义（P＞0.05）。②各组HE染色及PAS染色结果显示C与E组相较B及D组腺泡明显增多，组织形态改善。但较A组比较仍有差距。③下颌下腺体组织电镜超微结构：A组下颌下腺浆液细胞结构正常。B组及E组可见浆液细胞水肿变性坏死，核固缩，酶原颗粒明显减少。C组及F组，腺泡损害较轻，酶原颗粒较丰富，细胞水肿较轻。浆液细胞结构基本完整。④各组细胞凋亡检测：凋亡指数A组0+4.4%，B组49.5±5.6%，C组31.7±3.6%，D组52.1±4.9%，E组27.6±6.4%。 B组，C组，D组，E组分别与A组比较均有统计学意义（P＜0.05），C组与E组，B组与D组两两组间比较统计学分析无差异（P＞0.05）。C组与B组，D组比较、E组与B组，D组比较统计学分析均有差异（P＜0.05）。【结论】1．动物模型18Gy局部照射组小鼠下颌下腺受损明显，但全身影响较小。18Gy是建模的最佳局部照射剂量。确定此剂量为实验照射剂量，建立小鼠涎腺放射损伤的动物模型。局部照射后较长时间内腺泡细胞持续损失减少，照射后3月是进行干细胞体内移植的最佳时间节点。2．ASCs含量丰富，取材方便，生长快，分化能力强，更易培养和消化传代，是不可多得的组织工程种子细胞。3．荧光标记ASCs体内注射后在小鼠受损腺体中出现了明确的干细胞归巢现象，证实干细胞能特异性归巢于小鼠受损涎腺组织。4. ASCs尾静脉或腺体局部注射均可能体内转化为腺泡细胞，部分修复重建小鼠损伤涎腺功能及组织形态。