研究背景:酰胺类物质是重要的精细化工原料和医药中间体。腈水合酶是一种能够催化腈类化合物水合成酰胺类化合物的金属酶,具有很高的工业应用价值。与传统的化学合成法相比,采用腈水合酶生物催化法生产酰胺类化合物具有反应条件温和、专一性强、催化效率高的优势。但目前从自然界土壤取样分离筛选获得野生产酶菌株的方式具有偶然性大、成功率低、酶活力差等局限性,而通过基因克隆手段获得高效表达腈水合酶的基因工程菌具有生物遗传背景清晰、适应性强、发酵周期短、有利于实现大规模培养和工业化生产等优点,符合经济环保的绿色化工发展方向。研究目的:探究红球菌Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶的相关性能,以期为工业化生产酰胺类物质提供理论依据。研究方法:(1)设计质粒:通过基因工程技术实现腈水合酶在大肠杆菌中的异源表达;(2)探究腈水合酶的底物特异性:选用静息工程菌细胞与不同腈类底物(丙烯腈、丙二腈、烟腈、己二腈、对苯二腈、苯甲腈)反应,使用气液相色谱检测反应结果;(3)探究静息细胞反应影响因素:从温度稳定性、pH稳定性、最适温度、最适pH、底物耐受性等方面探究对酶活的影响;(4)完成腈水合酶的纯化:添加His标签完善质粒设计并利用亲和层析技术得到纯化酶。研究结果:(1)成功实现腈水合酶在大肠杆菌中的可溶性异源表达;(2)重组菌对单腈催化效果较弱,对二腈有较好的催化活性,并表现出了优异的区域选择性。可在10 min内完全催化20 mM/L己二腈,对5-氰基戊酰胺选择性为95%,酶活可达635 U/g(DCW);(3)重组菌在催化己二腈反应时的最适温度为35℃、最适pH为7.4且在室温和pH中性条件下具有良好的稳定性,可耐受200 mM/L的己二腈,5 h内将其转化完全;(4)通过在α亚基后添加His标签序列,得到新质粒并完成纯化操作,纯化酶单亚基分子量为27 KDa,催化己二腈反应的比酶活为2917 U/g。结论:红球菌Rhodococcus erythropolis CCM2595来源的腈水合酶在大肠杆菌中实现了功能稳定表达。该腈水合酶具有广泛的底物谱,对二腈的催化活性较为显著,可在常温中性条件下,短时高效地选择性催化己二腈生成5-氰基戊酰胺,同时具有较好的底物耐受性。本实验结果有望为5-氰基戊酰胺的工业生产提供新的思路和方案,为绿色化学的发展添砖加瓦。