一、研究背景胆肠吻合术是胆道重建最常用的方式之一,是治疗胆道、胰腺及十二指肠等疾病的重要手段。然而,在治疗疾病的同时,胆肠吻合术却也带来一定比例的并发症,术后吻合口狭窄是其中主要并发症之一。尤其对于无明显扩张的、直径比较细小的胆管行胆肠吻合术后,其吻合口狭窄发生率较高。有报道,医源性胆管损伤及良性胆管狭窄行胆肠吻合术后,其吻合口狭窄发生率高达51.7%,而活体肝移植的细小胆管行胆肠吻合后其狭窄发生率更高。胆肠吻合口狭窄可导致反复的腹痛、发热、黄疸甚至休克,长期的胆管炎症亦可引起癌变。胆肠吻合口狭窄发生后处理复杂,效果差。因此,如何预防小直径胆管胆肠吻合术后吻合口狭窄一直是肝胆外科的研究热点和难点。如何预防小直径胆管胆肠吻合口狭窄,临床上手段缺乏,效果欠佳。目前临床上多采用胆管整形扩大吻合口及长时间留置胆道支撑管的方法来预防小直径胆管胆肠吻合术后吻合口狭窄。然而,胆管整形需要将胆管切开、拼接后再与肠道吻合,需要胆管具备特定的整形条件,并且手术吻合技术要求高,难度大,术后也容易发生胆道反流,胆漏,胆管扭曲或挛缩形成梗阻等并发症。长时间在吻合口留置支撑管可导致胆管粘膜坏死、胆道感染、胆道狭窄、结石等并发症,而胆汁引流至体外也导致消化酶丢失、食欲不振、电解质紊乱,影响患者工作和生活,给患者造成很大经济及心理负担,因此利弊尚无定论。目前在胆肠吻合口狭窄形成的机制研究方面亦较少,术后吻合口狭窄发生的机制尚不明确。有学者提出,吻合口手术缝线异物反应加上针孔、吻合间隙处的胆汁渗漏损害导致持续的炎症反应,胆管断端成纤维细胞增生活跃导致的吻合口组织过度增生、瘢痕挛缩是术后吻合口发生狭窄的重要因素。另外,肠粘膜细胞亦具备增生修复能力,对于小直径的胆管来说,肠粘膜在吻合后向吻合口中心增生修复也有可能导致吻合口狭窄。二、研究目的本实验针对兔细小胆管设计了一种新的吻合方式,即拖入式胆肠吻合术。采用胆管直接拖入肠道的吻合方式行胆肠吻合,不缝合吻合口,吻合口不留置胆管断端。理论上可避免吻合口缝合后缝线反应及胆汁渗漏损害导致的持续炎症反应和胆管断端的成纤维细胞增生活跃导致的吻合口组织过度增生,而且拖入的胆管可抑制肠粘膜细胞向吻合口中心增生修复。研究目的：观察拖入式胆肠吻合术对预防兔细小胆管胆肠吻合术后吻合口狭窄的效果,术后通过病理切片和免疫组化检测Ki67指数了解吻合口炎症反应和组织增生情况,探讨拖入式胆肠吻合术作用的可能机制,为临床上预防小直径胆管胆肠吻合口术后狭窄提供一定的借鉴。三、研究方法1、SPF级健康雄性新西兰兔21只(由海军总医院动物实验室提供),体重2.15～2.58kg,平均2.29kg,随机分为3组,每组7只,A组行开关腹术(空白对照组)、B组行Roux-en-Y胆肠吻合术(对照组)、C组行拖入式胆肠吻合术(实验组)。2、手术步骤：①速眠新Ⅱ注射液1.5ml与盐酸氯胺酮注射液2ml混匀后以1ml/kg浓度肌肉注射麻醉,麻醉满意后,俯卧固定于手术板上,取腹部正中切口备皮、消毒、铺无菌洞巾。②A组：逐层切开腹壁后分层用4-0线直接关闭腹腔。③B组：切开进腹后距屈氏韧带远侧约15cm切断空肠,远侧空肠取约20cm空肠作Y空肠臂,近侧空肠与空肠臂断端以下约20cm行端侧吻合,Y空肠臂断端关闭。钝性分离出胆管,紧邻十二指肠以5-0丝线结扎后切断,断端与空肠闭合端约1.5cm侧壁开口用8-0可吸收线放大镜下行端侧粘膜对粘膜吻合。分层4-0线关闭腹腔。④C组：切开进腹后距屈氏韧带远侧约15cm切断空肠,远侧空肠取约20cm空肠作Y空肠臂,近侧空肠与空肠臂断端以下约20cm行端侧吻合,Y空肠臂断端关闭。钝性分离出胆管,紧邻十二指肠5-0丝线结扎后切断,胆管断端用5-0长丝线结扎且剪去单根线尾。于空肠闭合端约1.5cm、3cm处分别开约3mm、8mm孔,将胆管由3mm孔处拖入,8mm孔处拖出,胆管结扎端约5mm处侧壁纵行剪开约1.5mm引流胆汁,丝线穿针将胆管固定在肠壁上后关闭8mm的肠壁孔。分层4号线关闭腹腔。⑤术后禁食48小时,以葡萄糖氯化钠注射液150ml+注射用头孢唑啉钠0.25g/只／天进行补液,连续1周。3、指标检测、病理切片HE染色及免疫组化：手术时间,手术并发症情况。术后于2、4、8周经兔耳中央动脉抽血1.5ml,生化仪检测总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)。8周后动物处死取胆管及胆肠吻合口组织,游标卡尺测量胆管壁厚度、胆管腔和胆肠吻合口直径。取胆肠吻合口组织固定,石蜡包埋后选取胆管与肠管交界处,石蜡切片机冠状连续切片,HE染色,病理观察。石蜡切片行抗原修复,EnVision法行Ki67免疫组化染色,每张切片于400倍镜下选定10个视野,每个视野计数100个细胞,计算每张切片上阳性表达的细胞百分数为ki67指数。4、统计学处理：统计学方法采用SPSS13.0软件进行统计处理,实验数据采用x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,以P≤0.05为差异有统计学意义。四、结果1、一般情况：手术操作时间B组(2.0±0.3)h>C组(1.4±0.2)h>A组(0.2±0.0)h,两两间有显著差异(P<0.01),Roux-en-Y胆肠吻合组操作时间明显长于拖入式胆肠吻合组。围手术期中,B组2只死于胆漏,C组1只死于胆漏,1只死于肠漏。手术2周后B组动物开始出现食欲下降,尿色黄,术后7周B组1只死于肝功能衰竭,死亡动物均手术补齐。Roux-en-Y胆肠吻合组出现梗阻性黄疸,死亡率亦较拖入式胆肠组高。动物处死后A、C两组肝脏质地、颜色正常,B组肝脏颜色变黄、体积缩小、质地变硬,出现胆汁淤积性肝硬化。2、胆红素A组、C组术后第2、4、8周检测总胆红素及间接胆红素无明显改变,胆汁排泄正常,两组间比较胆红素无统计学差异。B组总胆红素及间接胆红素随着时间进行性升高,实验兔出现梗阻性黄疸,与A、C组比较有显著差异(P<0.01)。3、胆管壁厚度(mm)Roux-en-Y胆肠吻合组胆管壁明显增厚,拖入式胆肠吻合组胆管仅轻度增厚。Roux-en-Y胆肠吻合组(2.0±0.1)>拖入式胆肠吻合组(0.5±0.1)>开关腹组(0.3±0.1),两两间比较具有显著差异(P<0.01)。4、胆管腔直径(mm) Roux-en-Y胆肠吻合组胆管由于梗阻性黄疸,胆管扩张,胆管腔直径显著增大,拖入式胆肠吻合组胆管轻度扩张,胆管腔直径较单纯开关腹组有所增大。Roux-en-Y胆肠吻合组(10.7±0.8)>拖入式胆肠吻合组(2.8±0.3)>开关腹组(1.5±0.2),两两间比较具有显著差异(P<0.01)。5、胆肠吻合口直径mm Roux-en-Y胆肠吻合组吻合口出现完全闭合,测量时记为0,拖入式胆肠吻合口直径较单纯开关腹组增宽。Roux-en-Y胆肠吻合组(0.0±0.0)<开关腹组(1.5±0.2)<拖入式胆肠吻合组(12.4±4.2),两两间比较具有显著差异(P<0.01)。6、胆肠吻合口组织HE染色观察Roux-en-Y胆肠吻合口组织炎性增厚明显,HE染色见大量中性粒细胞浸润。拖入式胆肠吻合口组织未见明显增厚,HE染色见少量中性粒细胞浸润。开关腹组HE染色无明显中性粒细胞浸润。7、免疫组化检测ki67指数(%)Roux-en-Y胆肠吻合组(68.9±10.7)>拖入式胆肠吻合组(34.4±9.2)>开关腹组(12.4±4.2),两两间比较具有显著差异(P<0.01)。五、结论1、拖入式胆肠吻合较Roux-en-Y胆肠吻合组操作时间减少,操作简化,围手术期及术后并发症少。2、兔细小胆管行拖入式胆肠吻合术后胆红素无明显改变,胆汁排泄正常,术后胆管轻度扩张,胆肠吻合口较单纯开关腹组增宽,显示拖入式胆肠吻合能预防兔细小胆管胆肠吻合术后的吻合口狭窄,可为临床上预防小直径胆管胆肠吻合术后吻合口狭窄提供一定的借鉴。3、拖入胆肠吻合术后吻合口组织中性粒细胞浸润少,炎症程度轻,一定程度上提示了将胆管直接拖入肠道能避免缝合材料异物反应和缝合口针孔、吻合间隙胆汁渗漏导致的持续的炎性反应。拖入胆肠吻合术后吻合口组织免疫组化检测Ki67指数低,组织细胞增生轻,一定程度上提示了拖入式胆肠吻合避免了吻合口胆管断端的成纤维细胞过度增生和胆管外膜抑制了肠粘膜细胞向吻合中心的增生修复。4.Roux-em-Y胆肠吻合口组织明显水肿,中性粒细胞大量浸润,炎症反应重,考虑与缝合材料异物反应和缝合针孔、吻合间隙胆汁渗漏损害导致的持续的炎性反应有关。Roux-en-Y胆肠吻合口组织增厚明显,免疫组化检测Ki67指数明显增高,组织过度增生,吻合口出现完全闭合,考虑与胆管断端纤维断裂成纤维细胞增生活跃、瘢痕挛缩与肠粘膜细胞向吻合口中心增生修复有关。5、本实验表明拖入式胆肠吻合术能预防兔细小胆管胆肠吻合术后出现吻合口狭窄。其可能机制是避免缝合,规避了缝和材料异物反应及缝合针孔、吻合间隙胆汁渗漏的胆汁损害导致的持续炎症反应；将胆管直接拖入肠道,吻合口没有胆管断端,避免了成纤维细胞增生活跃导致的吻合口组织过度增生;而且胆管外膜抑制了肠粘膜细胞向吻合中心的增生修复。拖入式胆肠吻合效果及机制有待于进一步探讨,为临床上预防小直径胆管胆肠吻合术后吻合口狭窄提供一定的借鉴。