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本课题采用体外构建的CD40RNA干扰(RNA interference, RNAi)慢病毒载体修饰小鼠骨髓来源的树突状细胞(dendritic cell, DC),通过抑制DC表面CD40的表达,阻断CD40/CD40L共刺激通路,进而探讨诱导T淋巴细胞无能的机理。研究低表达CD40的供体耐受性DC (tolerogenic DC, Tol-DC)与FTY720在同种异系心脏移植中的抗排斥反应作用机制。第一部分慢病毒介导RNAi敲减树突状细胞CD40表达及诱导T细胞无能的研究目的：构建针对小鼠CD40基因的RNAi慢病毒载体,制备低表达CD40的Tol-DC,探讨其阻断CD40/CD40L共刺激通路诱导异系T淋巴细胞无能的作用机制。方法：体外培养小鼠骨髓源DC；构建针对小鼠CD40基因的RNAi慢病毒载体。设置未感染组、NC-GFP-LV(阴性对照病毒)感染DC组和CD40-RNAi-LV感染DC(24h,48h,72h)五组,荧光实时定量PCR及流式细胞术检测感染前后CD40mRNA及DC表面抗原CD40, CDllc、MHCⅡ表达。混合淋巴细胞培养观察CD40-RNAi慢病毒感染DC对异系T淋巴细胞增殖能力的影响。结果：成功构建小鼠CD40-RNAi慢病毒载体,检测滴度为8E+9TU/Ml。慢病毒载体感染DC后,CD40-RNAi-LV感染DC(24h、48h、72h)三组(41.8%、80.9%、83.0%)与未感染组相比,明显抑制CD40mRNA的表达(P<0.05)。感染后48h的CD40mRNA抑制率高于24h,而感染后72h与48h相比,CD40mRNA表达抑制率无差异(P＞0.05)。CD40-RNAi-LV感染DC后48h(40.07%±4.03%)和72h(26.32%±3.60%)两组与未感染组(74.37%±4.08%)相比,CD40蛋白表达明显减少(P<0.05)。并且,72h的CD40蛋白表达明显低于48h(P<0.05)。未感染组、NC-GFP-LV感染DC组(72.45%±2.65%)和CD40-RNAi-LV感染DC后24h组(70.83%±4.87%)之间,CD40蛋白表达无差异(P＞0.05)。CDllc、MHCⅡ蛋白表达在慢病毒感染DC前后无明显变化(P>0.05)。混合淋巴细胞培养显示,CD40-RNAi-LV感染DC组(1.381±0.442)与未感染组(2.444±0.485)及NC-GFP-LV (2.294±0.367)感染DC组相比,淋巴细胞刺激指数(SI)明显下降(P<0.01)；未感染组及NC-GFP-LV感染DC组相比,SI无显著差异(P>0.05)。结论：成功构建针对小鼠CD40基因的RNAi慢病毒载体,为体内实验的研究提供了稳定可靠的载体。CD40-RNAi慢病毒载体感染DC可显著抑制CD40表达,阻断CD40/CD40L共刺激通路,抑制异系T淋巴细胞的活化,诱导T细胞无能。第二部分CD40-RNAi慢病毒载体感染DC与FTY720在同种异系小鼠心脏移植中的抗排斥反应作用研究目的：观察输注供体小鼠CD40-RNAi慢病毒载体感染DC与FTY720对同种异系小鼠心脏移植排斥反应的作用,探讨不同的抗排斥机制。方法：建立小鼠异位腹腔心脏移植模型。设置异系对照组、未感染DC组、FTY720灌胃组、慢病毒感染DC组、慢病毒感染DC联合FTY720灌胃组。观察各组移植心脏存活时间,评定术后7天移植物排斥反应病理分级,并以流式细胞术检测手术前后外周血CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)的变化水平。结果：成功构建同种异系小鼠异位心脏移植模型。与异系对照组(中位生存期8天)和未感染DC组(中位生存期9天)相比,CD40-RNAi慢病毒感染DC组(中位生存期18天)移植心脏存活时间明显延长(P<0.01)；慢病毒感染DC组术后7天的急性排斥反应病理分级较异系对照组明显降低(P<0.01)；与异系对照组(2.16%±1.00%)和未感染DC组(3.49%±1.49%)相比,慢病毒感染DC组术后3天(24.2%±6.06%)、术后7天(22.8%±3.34%)外周血CD4+CD25+Treg水平均明显升高(P<0.01)。慢病毒感染DC联合FTY720灌胃组(中位生存期26天)与慢病毒感染DC组相比,移植心脏存活时间明显延长(P<0.01),而急性排斥反应病理分级、手术前后外周血CD4+CD25+Treg水平均无明显差异(P>0.05)。结论：小鼠异位腹腔心脏移植模型是研究移植排斥反应的理想动物模型。CD40-RNAi慢病毒感染供体来源的DC对同种异系小鼠心脏移植有抗排斥作用,其机制可能为低表达CD40的Tol-DC阻断CD40/CD40L共刺激通路,并刺激CD4+CD25+Treg的生成,诱导受体T淋巴细胞无能。FTY720联合阻断CD40/CD40L通路与单独阻断CD40/CD40L通路相比,更为有效的诱导免疫耐受。