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背景和目的:血管钙化（Vascular calcification,VC）是糖尿病血管病变过程中的特征性改变,其关键环节是血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）的衰老和成骨样分化。我们课题组前期在临床2型糖尿病患者的膳食调查中发现,喜食辛辣食物的患者与不嗜辣者相比,脉搏波速度和脉压差更小,提示辛辣饮食有助于改善血管弹性,降低血管僵硬度。辣椒素是辣椒的主要辛辣和活性成分,通过激活瞬时受体电位香草酸亚型1（Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1）来发挥作用。近年来研究发现长寿蛋白Sirtuins（SIRTs）不仅调节细胞衰老,还可抑制血管钙化。我们前期研究发现辣椒素可抑制高糖诱导的血管内皮细胞的衰老,其机制与激活TRPV1上调SIRT1水平有关。为探明辛辣饮食对糖尿病患者的血管保护机制,并探究TRPV1是否能成为调节血管钙化的重要靶点,本研究从培养的VSMCs和2型糖尿病大鼠模型进一步观察辣椒素对VSMCs衰老及钙化的影响,结合慢病毒转染TRPV1sh RNA确定TRPV1的作用,并明确其机制是否与调控SIRTs水平有关。方法:1.细胞水平:分离SD大鼠胸主动脉,采用组织贴壁法培养原代VSMCs,细胞免疫荧光检测平滑肌细胞特异性标志物α-SMA,取3-6代细胞用于后续实验。（1）高糖高磷（30m M葡萄糖,10m Mβ-磷酸甘油钠）处理VSMCs 14天,给予不同浓度辣椒素（1μM,3μM,10μM）观察其对高糖高磷诱导VSMCs衰老及钙化的影响。VSMCs衰老相关检测:Western blotting检测衰老相关蛋白P21和P16的表达水平,β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞数量,荧光显微镜观察细胞内ROS水平,Elisa检测细胞上清液中衰老相关分泌表型IL-6和IL-1β的水平;VSMCs钙化相关检测:Western blotting检测收缩型标志蛋白α-SMA、成骨转录因子RUNX2及成骨标志蛋白OPN、BGLAP、COLⅠ的表达水平,并采用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色法检测细胞内成骨分化和钙化情况;Western blotting检测SIRT1和SIRT6的表达水平。（2）探究TRPV1-sh RNA对VSMCs衰老及钙化的影响。通过慢病毒转染sh RNA使TRPV1沉默,Western blotting观察SIRT1和SIRT6的表达和成骨分化相关蛋白（RUNX2、OPN和BGLAP）的表达,β-半乳糖苷酶染色检测衰细胞数量。2.整体动物水平:将SD大鼠分为三组:正常组（Con）、糖尿病组（DM）、糖尿病+膳食辣椒素组（DM+Cap）。高糖高脂饲料喂养雄性SD大鼠联合腹腔注射链脲霉素（STZ）构建2型糖尿病大鼠模型,DM+Cap组给予添加0.01%辣椒素的高糖高脂饲料喂养10周。提取大鼠胸主动脉组织和血清用于后续实验。（1）膳食辣椒素对糖尿病诱导血管平滑肌衰老的影响:HE染色观察各组胸主动脉血管壁结构,免疫组化和Western blotting检测血管平滑肌P21和P16的表达水平,Elisa检测血清中胰岛素及衰老相关分泌表型IL-6、MMP-9和TNF-α的含量,血清检测血脂四项（胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白）。（2）膳食辣椒素对糖尿病诱导血管平滑肌钙化的影响:Western blotting检测三组胸主动脉组织成骨分化相关蛋白（RUNX2、OPN、BGLAP和COLⅠ）以及长寿蛋白（SIRT1和SIRT6）的水平。结果:1.辣椒素显著抑制高糖高磷诱导的VSMCs衰老,表现为减少高糖高磷诱导的VSMCs衰老数目,下调衰老相关蛋白P21和P16的表达,降低高糖高磷诱导的ROS生成,并抑制IL-6和IL-1β的分泌。2.辣椒素可显著抑制高糖高磷诱导的成骨分化和钙化:Western blotting结果显示,辣椒素剂量依赖性恢复VSMCs中收缩型标志蛋白α-SMA水平,并抑制成骨相关标记蛋白RUNX2、OPN、BGLAP和COLⅠ的表达;碱性磷酸酶染色和茜素红S染色结果显示高糖高磷促进了VSMCs的钙化,辣椒素可显著减少细胞内碱性磷酸酶活性和钙盐沉积。3.高糖高磷可降低VSMCs中SIRT6的水平,而辣椒素可恢复高糖高磷抑制SIRT6的蛋白表达。4.TRPV1-sh RNA使VSMCs中TRPV1蛋白水平显著下调,同时SIRT1和SIRT6的蛋白表达水平也随之下调。与阴性对照（Ctrl-sh RNA）相比,TRPV1-sh RNA可促进VSMCs的成骨分化和衰老,表现为上调成骨标志分子RUNX2、OPN和BGLAP的水平,增加β-半乳糖苷酶染色阳性的衰老细胞数目。5.膳食添加0.01%辣椒素对糖尿病大鼠的空腹血糖和血脂水平并无显著影响,但可抑制糖尿病诱导的血管老化和钙化,表现为降低血管壁衰老相关蛋白P21和P16的水平,抑制IL-6的分泌,并降低胸主动脉成骨转录因子RUNX2及成骨标志蛋白OPN、BGLAP、COLⅠ的表达。此外,糖尿病大鼠血管壁SIRT6水平显著下降,膳食辣椒素可部分恢复SIRT6水平。结论:1.TRPV1激动剂辣椒素可上调长寿蛋白SIRT6水平,抑制高糖高磷诱导的VSMCs衰老及钙化,而TRPV1sh RNA可下调SIRTs水平,促进VSMCs的衰老和钙化。2.膳食添加辣椒素可上调SIRT6蛋白水平,抑制糖尿病大鼠的血管老化及钙化。