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研究背景骨是乳腺癌常见的远处转移器官,乳腺癌骨转移主要导致溶骨性病变,严重影响患者生存质量和生存期。阐明乳腺癌溶骨性骨转移的分子机制,有助于开发早期预测骨转移和有效治疗骨转移的诊断和治疗方法。课题组前期研究证实转录因子叉头框F2(Forkhead box F2,FOXF2)具有促进乳腺癌骨转移的作用。为了研究FOXF2调控乳腺癌骨转移的分子机制,通过乳腺癌组织基因表达谱数据的相关性分析,发现FOXF2与一组骨重塑相关基因呈相关性表达,其中包括组织蛋白酶K(Cathepsin K,CTSK)和尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-Type Plasminogen Activator,u PA或PLAU)。进一步通过FOXF2结合序列分析,发现CTSK和PLAU启动子区存在多个FOXF2的转录结合域,提示CTSK和PLAU是潜在的FOXF2转录调控靶基因。基于文献报道CTSK和PLAU具有促进乳腺癌溶骨性骨转移的作用,推测FOXF2可能通过转录调控CTSK和PLAU促进乳腺癌溶骨性骨转移。研究目的本研究旨在确定FOXF2对CTSK和PLAU的转录调控作用,以及CTSK和PLAU对FOXF2调控乳腺癌溶骨性骨转移的介导作用。研究方法1.通过公共数据库(GEO:www.nvbi.nlm.nih.gov/geo/info,Accession Number:GSE11121和GSE20685)分析在不同亚型乳腺癌中FOXF2 m RNA与CTSK m RNA和PLAU m RNA表达水平的相关性。2.通过染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)确定在乳腺癌细胞MDA-MB-231中FOXF2与CTSK和PLAU启动子中潜在结合位点的结合;通过双荧光素酶报告系统证实FOXF2对CTSK和PLAU启动子活性的调节作用;通过Western blot检测过表达或沉默表达FOXF2后,乳腺癌细胞系MCF-7、T47-D和MDA-MB-231中CTSK和PLAU的m RNA和蛋白水平的变化,证实乳腺癌细胞中FOXF2对CTSK和PLAU的调节作用。3.在MDA-MB-231中过表达FOXF2后沉默表达CTSK或PLAU和沉默表达FOXF2后过表达CTSK或PLAU,分析FOXF2在乳腺癌细胞中的表达对诱导成熟的MC3T3-E1模拟的骨微环境的趋化迁移能力、粘附能力、骨基质降解能力的调控作用,以及诱导小鼠破骨前体细胞分化成熟能力的调控作用。4.通过公共数据库(GEO:www.nvbi.nlm.nih.gov/geo/info,Accession Number:GSE14020)分析乳腺癌病理骨转移癌和非骨转移癌中CTSK和PLAU表达量的差异,以及CTSK和PLAU表达水平对发生单纯骨转移预后的影响。结果1.不同亚型乳腺癌(Luminal-like、Basal-like、Erbb2-Enrich)中FOXF2 m RNA与CTSK m RNA和PLAU m RNA表达水平成正相关性。2.通过Ch IP发现,在CTSK启动子上?586/?579和–732/–725位置存在两个FOXF2结合位点,在PLAU启动子上?1082/?1075、?1109/?1102和?1784/?1777位置存在三个FOXF2结合位点;在MDA-MB-231细胞中沉默FOXF2表达,CTSK和PLAU启动子活性降低,在MCF-7细胞中过表达FOXF2,CTSK和PLAU启动子活性增强。3.在MDA-MB-231细胞中沉默FOXF2表达,CTSK和PLAU蛋白表达水平降低;在MCF-7细胞和T47-D细胞中过表达FOXF2,CTSK和PLAU蛋白水平没有变化。4.沉默FOXF2表达,MDA-MB-231细胞向经诱导成熟的成骨细胞MC-3T3E1模拟的骨微环趋化迁移能力增强,向肺上皮细胞BEAS-2B模拟的肺微环境趋化迁移趋化能力减弱;过表达FOXF2后沉默CTSK或PLAU表达,MDA-MB-231细胞向经诱导成熟的成骨细胞MC-3T3E1模拟的骨微环趋化迁移能力减弱,向肺上皮细胞BEAS-2B模拟肺微环境的趋化迁移趋化能力没有明显改变。5.沉默FOXF2表达,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附能力减弱,沉默FOXF2表达后过表达CTSK,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附能力没用明显改变;沉默FOXF2表达后过表达PLAU,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附增强;过表达FOXF2,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附能力增强;过表达FOXF2后沉默CTSK表达,MDA-MB-231细胞对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附没有明显变化;过表达FOXF2后沉默PLAU表达,MDA-MB-231对成骨细胞和骨基质蛋白的粘附减弱。6.沉默FOXF2表达,MDA-MB-231细胞对骨基质降解能力减弱,沉默FOXF2表达再过表达CTSK或PLAU,MDA-MB-231细胞对骨基质降解能力增强。过表达FOXF2 MDA-MB-231细胞对骨基质降解能力增强,过表达FOXF2后沉默CTSK或PLAU表达MDA-MB-231细胞对骨基质降解能力减弱。7.沉默FOXF2表达,MDA-MB-231细胞条件培养基诱导破骨细胞成熟的能力降低,沉默FOXF2表达再过表达CTSK或PLAU,MDA-MB-231细胞条件培养基诱导破骨细胞成熟的能力得到很大程度的增强;过表达FOXF2表达,MDA-MB-231细胞条件培养基诱导破骨细胞成熟的能力增强,过表达FOXF2表达再沉默CTSK或PLAU表达,MDA-MB-231细胞条件培养基诱导破骨细胞成熟的能力减弱。8.所有乳腺癌转移癌中,CTSK和PLAU在骨转移癌(n=18)中的表达量均高于非骨转移癌(n=94,P<0.0001),患者FOXF2高表达同时CTSK或PLAU高表达发生单纯骨转移生存率最高。结论1.CTSK和PLAU是FOXF2的转录调控靶基因,FOXF2在BLBC细胞中转录激活CTSK和PLAU表达,但在luminal亚型乳腺癌细胞细胞中对CTSK和PLAU表达无转录激活作用。2.FOXF2通过转录调控CTSK和PLAU表达促进乳腺癌细胞在骨微环境中的定植、降解骨基质、以及诱导破骨细胞分化成熟,从而促进溶骨性骨转移。3.FOXF2 m RNA水平及其与CTSK或PLAU m RNA水平可预测乳腺癌患者发生骨转移的风险。