近年来的医学研究发现,通过分子修饰可大大提高中药多糖的生物活性,并能产生许多新的药用价值。突出表现在某些多糖原来不具有生物活性或生物活性很弱,经硒化修饰以后,产生或增强了某些生物活性,尤其是增强免疫和抗氧化活性显示了广阔的药用前景。本研究选择淫羊藿多糖(EPS)和板蓝根多糖(IRPS)进行硒化修饰,分别得到9个硒化淫羊藿多糖(sEPS)和9个硒化板蓝根多糖(sIRPS),以未修饰多糖为对照,通过体外、体内试验,比较它们的增强免疫和抗氧化活性。本研究的目的,旨在探讨硒化修饰提高两种多糖增强免疫和抗氧化活性的可能性,筛选出效果较好的硒化多糖,为研制多糖类免疫增强剂和抗氧化剂提供理论依据。研究包括以下六个部分:试验Ⅰ、硒化淫羊藿多糖和硒化板蓝根多糖的制备用水煎醇沉法提取粗淫羊藿多糖和粗板蓝根多糖,经Sevag法除蛋白,DEAE-52柱层析,得到纯化的淫羊藿多糖和板蓝根多糖。然后用硝酸-亚硒酸钠法进行硒化修饰,以反应温度、亚硒酸钠用量和反应时间三因素、三水平正交设计9种修饰条件,分别得到9个硒化淫羊藿多糖sEPS1～sEPS9和9个硒化板蓝根多糖sIRPS1～sIRPS9,用氢化物发生-原子荧光光谱法测定硒含量,用红外光谱鉴定硒多糖的结构。结果显示,两种硒化多糖的硒含量分别在3.32～21.89 mg·g-1、2.65～15.21 mg·g-1,红外光谱显示有硒酸酯基团的特征性吸收峰,证明两种多糖被成功硒化。试验Ⅱ、硒化淫羊藿多糖和硒化板蓝根多糖体外增强免疫活性的比较将9个硒化淫羊藿多糖sEPS1～sEPS9、9个硒化板蓝根多糖sIRPS1～sIRPS9及未修饰的EPS、IRPS分别用RPMI-1640培养液稀释成11个浓度,加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,用MTT法测定其最大安全浓度;然后取安全范围内5个浓度的各多糖单独或与PHA同时加入到鸡外周血淋巴细胞的培养体系中,培养48 h后,用MTT法测定淋巴细胞A570值和细胞增殖率的变化。结果显示,多糖单独加入时,各多糖组分别有1～5个浓度组的A570值显著大于细胞对照组,sEPS1、sEPS4、sEPS5和sIRPS6在1.563～0.098μg·mL-1组的A570值显著大于细胞对照组,sEPS2、sEPS4、sEPS5和sEPS8组的淋巴细胞增殖率显著高于EPS组;sIRPS5、sIRPS8和sIRPS9组的淋巴细胞增殖率显著高于IRPS组;多糖与PHA同时加入时,各多糖组分别有1～5个浓度组的A570值显著大于细胞对照组,sEPS1～sEPS9、sIRPS2、sIRPS4、sIRPS5、sIRPS8和sIRPS9在 1.563～0.098μg·mL-1组的A570值显著大于细胞对照组,sEPS2、sEPS5和sEPS8组的淋巴细胞增殖率显著高于EPS组,sIRPS2和sIRPS5组的淋巴细胞增殖率显著高于IRPS组。结果表明,硒化修饰能够提高淫羊藿多糖和板蓝根多糖的增强免疫活性,其中sEPS5在9个sEPSs中、sIRPS5在9个sIRPSs中的活性最强。试验Ⅲ、硒化淫羊藿多糖和硒化板蓝根多糖体外抗氧化活性的比较将9个硒化淫羊藿多糖sEPS1～sEPS9、9个硒化板蓝根多糖sIRPS 1～sIRPS9及未修饰的EPS、IRPS分别用蒸馏水倍比稀释成五个浓度,分别用自由基清除试验,测定各多糖对DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基的清除能力。结果显示,sEPS1、sEPS4、sEPS7在2～0.5 mg·mL-1对DPPH自由基的清除率均显著大于未修饰的EPS,sIRPS4、sIEPS7和sIRPS8在2～0.125 mg·mL-1对DPPH自由基的清除率显著大于未修饰的IRPS;sEPS4和sEPS7在1～0.0625 mg·mL-1对羟自由基清除率显著大于未修饰的EPS,sIRPS7在1～0.0625 mg·mL-1对羟自由基的清除率显著大于未修饰的IRPS;sEPS1、sEPS4和sEPS7在1～0.0625 mg·mL-1对ABTS自由基清除率显著大于未修饰的EPS,sIRPS7在1～0.0625mg·mL-1对ABTS自由基的清除率显著大于未修饰的IRPS。结果表明,硒化修饰能提高淫羊藿多糖和板蓝根多糖的体外抗氧化活性,sEPS7在9个sEPSs中、sIRPS7在9个sIRPSs中的活性最强。试验Ⅳ、硒化淫羊藿多糖和硒化板蓝根多糖体内增强免疫活性的比较以未修饰的EPS和IRPS为对照,比较前期筛选出的两个硒化多糖sEPS5和sIRPS5的体内增强免疫活性。14日龄雏鸡180只随机分为6组,除空白对照组(BC)外均用新城疫疫苗免疫,28日龄二免。在每次免疫的同时,4个多糖组分别每只肌肉注射2 mg·mL-1的sEPS5、sIRPS5、EPS和IRPS 0.5 mL,免疫对照(VC)组和BC组注射等量生理盐水。分别于首免后第7、14、21、28 d采血,测定外周血淋巴细胞增殖、血清ND抗体效价、IL-2、IL-6和IFN-y含量,分别于首免后第14、28 d测定免疫器官指数。结果显示,两个硒化多糖组在免疫后所有时间点的淋巴细胞增殖、血清抗体效价、IL-2、IL-6和IFN-y含量均显著高于VC和BC组,多显著高于未修饰多糖组,sEPS5组多为最高;在首免后D14,sEPS5和sIRPS5组的胸腺指数、脾脏和法氏囊指数交替最高。结果表明,硒化修饰能够提高两种多糖的体内增强免疫活性,sEPS5的活性最强。试验Ⅴ、硒化淫羊藿多糖和硒化板蓝根多糖体内抗氧化活性的比较体外筛选出抗氧化活性较强的sEPS7和sIRPS7,本试验进一步比较了两个硒化多糖的体内抗氧化活性。14日龄雏鸡180只随机分为6组,除空白对照组(BC)外均用新城疫疫苗免疫,28日龄二免。在每次免疫的同时,4个多糖组分别每只鸡肌肉注射2 mg·mL-1的sEPS5、sIRPS5、EPS和IRPS0.5mL,免疫对照(VC)组和空白对照组(BC)组注射等量生理盐水。分别于首免后第7、14、21、28 d采血,测定血清CAT、SOD、GSH-Px的活性及MDA的含量。结果显示,sEPS7在所有时间点的血清CAT活性均高于免疫对照组,sIRPS7有两个时间点的血清CAT活性均高于免疫对照组;sEPS7和sIRPS7在所有时间点的血清SOD活性、GSH-Px活性均高于免疫对照组;sEPS7在所有时间点、sIRPS7在两个时间点的血清MDA含量均显著低于免疫对照组。以上试验结果表明,硒化修饰能提高淫羊藿多糖和板蓝根多糖的体内抗氧化活性,sEPS7的活性最强。试验Ⅵ、硒化淫羊藿多糖对鸡外周血淋巴细胞IL-2、IL-6和IFN-γmRNA表达的影响本研究探讨了硒化多糖sEPS5对IL-2、IL-6和IFN-γmRNA表达的影响。培养鸡外周血淋巴细胞,分别加入3个浓度(6.25、3.125、1.563 μg·mL-1)的sEPS5和EPS,培养12h后,收集淋巴细胞,提取RNA,然后反转录成cDNA,用荧光定量RT-PCR方法测定IL-2、IL-6和IFN-y的mRNA表达的变化。结果表明,sEPS5在3.125和1.563μg·mL-1 IL-2mRNA 表达显著强于未修饰的 EPS;sEPS5在 1.563μg·m L-1IL-6 mRNA表达显著强于未修饰的EPS;sEPS5在1.563 μg·mL-1 IFN-γ mRNA表达显著强于未修饰的EPS。结果表明,硒化多糖促进IL-2、IL-6和IFN-γmRNA表达的作用显著强于未修饰多糖,可能是硒化修饰增强多糖免疫活性的机理之一。