论文部分内容阅读
1981年Siegel提出了“红细胞免疫系统”的新概念,打破了划分血细胞功能的传统界限。2004年郭峰提出了血液免疫反应路线图理论,认为血液中85%的免疫复合物被红细胞黏附后运送到吞噬细胞、网状内皮系统清除或通过递呈给T细胞等途径进行杀灭,红细胞免疫在血液免疫反应中起主干道作用.在红细胞免疫功能中,补体受体1（complement receptor type 1,CR1）的免疫黏附功能和达菲抗原/趋化因子受体（Duffy antigen/receptor for chemokines,DARC）的趋化因子受体功能最受关注,CD59则具有限制人补体系统溶细胞活性、介导红细胞.T细胞信号传递的作用.而具有辅助功能的CD4+T细胞和具有抑制及直接杀伤功能的CD8+T细胞共同行使T细胞特异性免疫功能。我国系统性红斑狼疮（SLE）发病率居世界首位,治疗属世界难题,肝癌发病率和死亡率居高不下。研究实践或理论推测表明,红细胞CR1、DARC、CD59和T细胞亚群在SLE和肝细胞癌（HCC）患者发生或可能发生表型改变,但缺乏综合、详尽研究,且红细胞免疫分子表型检测方法不规范,难以保证结果可靠性和可比性;目前缺乏这些分子的基因单核苷酸多态性（SNP）与疾病遗传易感性的关联研究.本研究探讨了红细胞免疫分子、T细胞亚群水平及相关基因SNP与SLE、HCC的关联,主要研究内容、方法和结果如下:1.红细胞CR1、CD59、DARC分子水平测定方法的建立及优化:采用直标法流式细胞术测定各分子水平,比较数据分析方法[阳性红细胞百分率、几何平均荧光强度（GMFI）和几何平均荧光强度比值（GMFIR）]的可靠性,以及抗凝剂（EDTA-K2、肝素锂、枸橼酸钠）、标本放置时间和抗体用量对测定结果的影响。结果:M1界值选择对CR1阳性红细胞百分率结果有很大影响,且此指标不能反映样本间DARC、CD59水平的差异;CR1（CD59）-GMFI随荧光通道电压升高而增加,而其GMFIR不受电压影响;抗凝剂种类及标本放置72h内,测定结果组间差异无显著统计学意义（P>O.05）;取5×105个人红细胞时,测定CR1、CD59、DARC最佳抗体量分别为7μl、7μl和3μl.2.候选基因SNP位点检测方法的建立及优化:采用配对标志法挑选候选基因标签SNP,设计多重引物,单重PCR验证多重PCR引物质量,采用多重PCR-荧光标记单碱基延伸-标签微阵列杂交基因分型技术检测91例健康人基因组DNA候选标签SNP,利用SNPstream（?）系统软件确定个体基因型,分型成功率>90%的SNP位点入选后续研究;对46份DNA样本重复测定,计算各SNP位点分型结果符合率。结果:CR1、DARC、CD59、CD4、CD8A、CD8B等6个基因初选获得了38个标签SNP位点,电泳显示各单重PCR均可扩增出与目标片段大小一致的产物;有8个SNP位点基因分型成功率<90%,分型率>90%的30个SNP位点中,rs2707212、rs3829972、rs10200219等3个SNP位点分型符合率<90%,其余27个SNP位点分型符合率93.5%.100.0%,总符合率达98.4%.3.健康人红细胞免疫分子、T细胞亚群水平及相关基因SNP位点特点:检测健康人红细胞CR1、DARC、CD59和T细胞亚群水平以及CR1等6个基因30个SNP位点;基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡（HWE）的SNP位点入选后续研究,利用Haploview V4.1软件对SNP位点进行连锁不平衡分析,采用四配子法构建单体型域,推算单体型频率,分析各SNP位点基因分型及频率>5%的单体型与性别的关联;分析红细胞免疫分子、T细胞亚群指标间及其与性别、年龄和SNP分型之间相关性,采用单因变量多因素一般线性模型筛选各指标主要影响因素.结果:红细胞CR1、DARC、CD59指标间及与CD4+、CD8+T细胞百分率间均无显著相关（P>0.05）.rs2707212、rs3829972、rS10200219等3个SNP位点基因型频率不符合HWE（P＞0.05）,其余27个SNP位点的基因型、等位基因分布均无显著性别差异（P＞0.05）。利用各基因SNP位点构建了6个单体型域,各单体型频率无显著性别差异（P>0.05）。CR1-GMFIR与rs4844600（GG/GA/AA）、rs9429945（CC/CT/TT）、rs11118167（TT/TC/CC）呈负相关（P<0.05,P<0.01,P<0.01）;DARC-GMFIR与性别（女/男）呈正相关（P<0.05）,与rs863002（CC/CT/TT）呈负相关（P<0.05）;CD4+T细胞百分率与rs11064404（TT/TC/CC）呈正相关（P<0.05）;CD8+T细胞百分率与年龄呈负相关（P<0.05）。上述相关因素中,除rs4844600外,其他因素均是对应免疫指标的主要影响因素（P<0.05或P<0.01）。4.应激因素对红细胞、T细胞免疫功能的影响:检测4℃保存悬浮红细胞及深、浅低温体外循环（CPB）手术前后红细胞CR1、CD59及T细胞亚群水平,比较3种复合应激因素对红细胞、T细胞免疫的影响趋势、程度。结果:4℃保存9周内各组红细胞CR1-GMFIR差异无统计学意义（P>0.05）;红细胞CD59-GMFIR呈逐渐下降趋势,组间差异有统计学意义（P＜0.01）.从CPB前至体温最低点或CPB末或术后1d,深、浅低温CPB患者红细胞计数,CR1-GMFIR、CD59.GMFIR、CD3+及CD4+T细胞百分率、CD4+T/CD8+T比值均呈下降趋势,之后逐渐回升,而淋巴细胞计数、CD8+T细胞百分率则于CPB前至CPB末上升,术后1d剧烈下降,然后再回升。深低温CPB患者CPB末红细胞计数较CPB前下降幅度与浅低温CPB接近,而CR1-GMFIR、CD59-GMFIR下降的幅度比浅低温CPB小,从CPB末或术后1d始其恢复速度较浅低温CPB快,至术后7d时,其红细胞计数、CD59-GMFIR相对CPB前水平上升的幅度较浅低温CPB大,CR1-GMFIR恢复至CPB前水平,而浅低温CPB远未恢复。CPB末时,浅低温CPB患者淋巴细胞计数较CPB前大幅升高,而深低温CPB患者轻度降低,深低温CPB患者CD3+和CD4+T细胞百分率、CD4+T/CD8+T比值降低程度大于浅低温,而CD8+T细胞百分率升高幅度大于浅低温:术后1d,深低温CPB患者CD8+T细胞百分率仍高于CPB前,而浅低温CPB却低于CPB前;多数指标于术后1d起开始回升,但深低温CPB恢复速度较浅低温CPB慢,且至术后7d时常不能恢复至CPB前水平。3种复合应激因素损害红细胞免疫功能的程度依次为:4℃保存<深低温CPB<浅低温CPB。5.红细胞免疫分子、T细胞亚群水平及相关基因SNP与SLE的关联:检测SLE患者及健康人红细胞CR1、DARC、CD59、T细胞亚群水平及27个SNP位点基因型,比较组间红细胞免疫分子、T细胞亚群水平和基因型、等位基因及频率>5%的单体型的分布差异,计算比值比（OR）及其95%可信区间（CI）。结果:SLE组CR1-GMFIR、DARC-GMFIR、CD4+T/CD8+T比值低于对照组（P＜0.01,P＜0.05,P＜0.01）,而CD3+、CD8+T细胞百分率高于对照组（P<0.01）。有8个SNP位点和3个单体型与SLE发病关联（P<0.01或P<0.05）,与非携带者比较,CR1-rs4844600/GG基因型（OR:8.672,95%CI:3.864-19.462）及G等位基因（OR:7.419,95% CI:3.425-16.073）、CR1-rs3818361/CC基因型（OR:1.872,95% CI:1.113-3.149）及C等位基因（OR:1.575,95% CI:1.067-2.325）、CR1-rs11118167/TT基因型（OR:2.083,95%CI:1.065-4.071）及T等位基因（OR:1.941,95% CI:1.050-3.588）、CD59-rs11585/TT基因型（OR:2.294,95% CI:1.226-4.293）及T等位基因（OR:1.975,95% CI:1.351-2.888）、CD59-rs12576440/AG基因型（OR:25.673,95% CI:10.440-63.137）及G等位基因（OR:32.571,95% CI:13.916-76.235）、CD4-rs1055141/CT基因型（OR:2.280,95% CI:1.261-4.123）及T等位基因（OR:2.210,95% CI:1.293-3.778）、CD8B-rs13400210/TT基因型（OR:8.661,95% CI:1.066-70.378）及T等位基因（OR:8.389,95% CI:1.041-67.613）、CD8B-rs4832054/AG基因型（OR:2.046,95% CI:1.055-3.967）、CR1-rs111118167-rs3818361-rs17048010/TCT单体型（OR:1.863,95% CI:1.288-2.693）、CD59-rs831629-rs12576440-rs1738548-rs2231454/TGTG单体型（OR:12.663,95% CI:4.959-32.336）和CD4-rs11064410-rs1055141-rs3213426-rs3213427/ATAT单体型（OR:2.478,95% CI:1.116-5.505）携带者患SLE风险增加。6.红细胞免疫分子、T细胞亚群水平及相关基因SNP与HCC的关联:方法同SLE病例对照研究.结果:HCC组CR1-GMFIR、DARC-GMFIR、CD59-GMFIR、CD3+及CD4+T细胞百分率低于对照组（DARC为,P<0.05,其余均P<0.01）;有5个SNP位点与HCC发病关联（P<0.01或P<0.05）,与非携带者比较,CR1-rs4844600/GG基因型（OR:2.458,95% CI:1.357-4.451）及G等位基因（OR:1.945,95% CI:1.183-3.199）、CR1-rs9429945/CC基因型（OR:1.76l,95% CI:1.006-3.084）、DARC-rs863002/CC基因型（OR:2-325,95%CI:0.990-5.462）及C等位基因（OR:2.191,95% CI:0.960-5.002）、CD8A-rs3020729/CT基因型（OR:1.936.95% CI:1.046-3.584）和CD8B-rs4832054/GG基因型（OR:2.354,95% CI:1.002-5.533）携带者患HCC风险增加。结论:1.成功建立并优化了直标法流式细胞术测定红细胞CR1、CD59、DARC水平及多重PCR-荧光标记单碱基延伸-标签微阵列杂交基因分型技术检测候选基因标签SNP的方法。2.调查了健康人红细胞CR1、DARC、CD59、T细胞亚群水平,探讨了各指标间的相关性及主要影响因素,确定了CR1等6个相关基因的27个标签SNP位点入选后续研究,构建了6个单体型域,各SNP位点基因型、等位基因、单体型频率均无显著性别差异。3.应激因素可损害红细胞、T细胞免疫.4℃保存悬浮红细胞对红细胞CR1-GMFIR影响小,对CD59-GMFIR影响较大。深低温CPB手术对红细胞免疫有轻度损害,而浅低温CPB损害较重;深低温CPB手术导致免疫抑制,浅低温CPB手术引发炎性反应。3种复合应激因素损害红细胞免疫的程度依次为:4℃保存<深低温CPB<浅低温CPB。4.SLE患者红细胞、T细胞免疫功能降低,CR1-rs4844600、rs3818361、rs11118167,CD59-rs11585、rs12576440,CD4-rs1055141,CD8B-rs13400210、rs4832054等8个SNP位点以及CR1-rs11118167-rs3818361-rs17048010/TCT、CD59-rs831629-rs12576440-rs1738548-rs2231454/TGTG、CD4-rs11064410-rs1055141-rs3213426-rs3213427/ATAT等3种单体型与SLE发病关联。5.HCC患者红细胞、T细胞免疫功能降低,CR1-rs4844600、CR1-rs9429945、DARC-rs863002、CD8A-rs3020729、CD8B-rs4832054等5个SNP位点与HCC发病关联。