【摘 要】
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蜡梅[Chimonanthus praecox（L.）Link]是中国传统的冬季名花,栽培历史悠久,具有极高的观赏价值,在园林绿化中得以广泛应用。蜡梅作为典型的冬季开花植物,生命力顽强,具有较强的抗寒、抗旱能力,推测其可能含有特异的抗逆基因。已有研究表明,转录因子能够在植物响应多种逆境胁迫中起调控作用,是抗逆信号转导通路中极为重要的分子开关。Di19（Drought-induced 19）转录因子
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蜡梅[Chimonanthus praecox（L.）Link]是中国传统的冬季名花,栽培历史悠久,具有极高的观赏价值,在园林绿化中得以广泛应用。蜡梅作为典型的冬季开花植物,生命力顽强,具有较强的抗寒、抗旱能力,推测其可能含有特异的抗逆基因。已有研究表明,转录因子能够在植物响应多种逆境胁迫中起调控作用,是抗逆信号转导通路中极为重要的分子开关。Di19（Drought-induced 19）转录因子,是一类与植物响应非生物胁迫密切相关的重要转录因子,不同物种中的研究证明其能广泛参与调控植物对干旱、高盐、高温等多种胁迫的应答。目前,对Di19基因的研究主要集中在模式植物中,尚未有蜡梅中Di19家族基因的克隆及相关功能的研究报道。本研究从蜡梅中克隆获得1个Di19家族基因,命名为CpDi19-5,并对其分子特性及功能进行了初步探索。实验获得的主要结果如下:1.CpDi19-5基因的克隆及分子特性分析利用研究室构建的蜡梅cDNA文库,通过PCR扩增技术克隆得到一个具有完整ORF框的蜡梅CpDi19-5基因的全长cDNA序列。序列分析发现,该基因的cDNA全长为788bp,含有一个657bp的最大开放阅读框,编码218个氨基酸。蜡梅CpDi19-5蛋白含有高度保守的zf-Di19和Di19＿C结构域,是典型的Di19家族转录因子。CpDi19-5蛋白不具有跨膜结构和信号肽序列,属于亲水性蛋白,主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。蛋白序列同源比对结果表明,CpDi19-5蛋白与其他物种中的Di19蛋白具有较高的相似性。构建进化树分析发现,CpDi19-5蛋白与莲花Nu Di19-5-like蛋白亲缘关系最近,故将其命名为CpDi19-5。2.CpDi19-5的亚细胞定位构建融合表达载体pCAMBIA1300-CpDi19-5-GFP在烟草下表皮细胞进行瞬时表达,发现融合表达载体在细胞核和细胞膜上有绿色荧光。结果表明CpDi19-5蛋白定位在细胞核和细胞膜上。3.CpDi19-5基因在蜡梅中的表达模式分析运用实时荧光定量PCR技术,分析在蜡梅不同组织、不同花发育时期以及不同胁迫和激素处理条件下CpDi19-5基因的表达模式。结果表明CpDi19-5基因在蜡梅的各个组织中均有表达,其中在花的各个器官中表达量较高。在蜡梅花的发育过程中,CpDi19-5基因在露瓣期到衰败期表达量较高。CpDi19-5基因经PEG和JA处理后,表达水平显著下降;经高温胁迫处理后,表达水平显著上升;而Na Cl、低温和GA处理下表达量无明显变化。4.转CpDi19-5基因拟南芥的表型分析和干旱胁迫研究运用Gateway技术构建植物超表达载体p GWB551-CpDi19-5,通过花序侵染法转化拟南芥,经过筛选鉴定获得纯合的T3代转基因拟南芥植株,选择表达量为高、中、低的三个株系进行表型观察和干旱胁迫实验。实验结果表明,与野生型相比,CpDi19-5基因并未影响转基因拟南芥的生长发育;干旱胁迫条件下,CpDi19-5基因显著降低了转基因拟南芥植株的干旱胁迫耐性,相关生理指标的测定也与干旱胁迫下的表型相符,表明CpDi19-5基因对拟南芥的耐旱性起负调控作用。初步判定,蜡梅CpDi19-5基因可能参与植物对干旱胁迫的响应,并能影响转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受性。
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