【摘 要】
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绿原酸作为多酚类物质的一员,具有抗氧化、抗炎、调节糖代谢等多种生物活性功能。由于绿原酸不稳定、低亲脂性,限制了其在生物体内的利用。本课题以绿原酸为研究对象,采用酶法对绿原酸进行分子修饰,制备出具有不同亲脂性的绿原酸酰化衍生物,并对其进行结构鉴定,确定酰化位点,同时考察绿原酸衍生物的体外消化稳定性、体外抗氧化性及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性,为绿原酸衍生物作为新型亲脂性抗氧化剂和α-淀粉酶和α
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绿原酸作为多酚类物质的一员,具有抗氧化、抗炎、调节糖代谢等多种生物活性功能。由于绿原酸不稳定、低亲脂性,限制了其在生物体内的利用。本课题以绿原酸为研究对象,采用酶法对绿原酸进行分子修饰,制备出具有不同亲脂性的绿原酸酰化衍生物,并对其进行结构鉴定,确定酰化位点,同时考察绿原酸衍生物的体外消化稳定性、体外抗氧化性及α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性,为绿原酸衍生物作为新型亲脂性抗氧化剂和α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制剂的应用提供理论依据。本文的主要结论如下:选用脂肪酶催化绿原酸和丁酸乙烯酯酰化反应,以绿原酸转化率为依据,对11种溶剂体系和9种脂肪酶进行筛选,确定最佳溶剂体系为10 m L甲基叔丁基醚,脂肪酶为Lipozyme RM。采用制备高效液相色谱对丁酰化绿原酸进行分离纯化,得到三种不同的组分。通过液质联用、红外光谱和核磁共振波谱对产物进行结构鉴定,分别为3-O-丁酰化绿原酸、4-O-丁酰化绿原酸和二丁酰化绿原酸,其中4-O-丁酰化绿原酸为主要酰化产物。随后对反应条件进行优化,确定最佳反应条件为反应温度:55℃、脂肪酶添加量:0.28 U/（mg绿原酸）、绿原酸和丁酸乙烯酯的摩尔比:1:10、反应转速:400 r/min、反应时间:4 d。不同碳链酰基供体实验发现酰基供体对绿原酸酰化的区域选择性影响最大,当酰基供体为月桂酸乙烯酯时,反应产物仅为4-O-月桂酰绿原酸。考察不同碳链修饰的4-O-单取代绿原酸衍生物的亲脂性,研究绿原酸衍生物的亲脂性对体外模拟消化稳定性、DPPH·和ABTS+·清除能力、铁离子还原能力和细胞抗氧化活性（CAA）的影响。结果表明,和绿原酸相比,在模拟胃消化阶段,绿原酸衍生物的稳定性有略微下降,在肠消化阶段,绿原酸衍生物的稳定性有不同程度提高,其中C4-CA的稳定性最好。自由基清除能力实验发现,除C4-CA外,其余衍生物的DPPH·清除能力显著低于绿原酸,但是仅C2-CA的ABTS+·清除能力显著下降。铁离子还原能力实验发现绿原酸衍生物的抗氧化能力明显下降。通过CAA实验证实,随着亲脂性的提高,绿原酸衍生物的跨细胞膜的能力增强,细胞抗氧化能力提高,C6-CA、C8-CA和C12-CA的细胞抗氧化活性显著高于绿原酸。研究不同碳链修饰的4-O-单取代绿原酸衍生物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用,通过抑制动力学和荧光猝灭对其抑制机制进行探讨。结果显示,C12-CA抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的效果最好,绿原酸衍生物对α-淀粉酶的抑制活性均高于绿原酸,且随着亲脂性的提高而增大;但是仅有C8-CA和C12-CA对α-葡萄糖苷酶的抑制活性高于绿原酸。抑制动力学和荧光猝灭实验结果表明,绿原酸及其衍生物对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制类型和猝灭机制均相同,仅在竞争性抑制常数(Kic)、非竞争性抑制常数(Kiu)和荧光猝灭常数(KFQ)上存在差别,C12-CA的Kic值和Kiu值最小,KFQ值最大,对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶构象的影响最大。
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