血管紧张素-(1-7)对心肌细胞缺血再灌注损伤的保护作用

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心肌缺血再灌注(Ischemia-reperfusion,IR)损伤是常见的临床现象,普遍存在于急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)及其溶栓(Thrombolysis)治疗、心脏移植(Heart transplantation)、冠脉旁路移植术(coronary artery bypassgrafting,CABG)、经皮冠状动脉介入治疗(Percutaneous coronary intervention,PCI)等过程中,缺血再灌注损伤(Ischemia-repeffusion iniury,IRI)的机制目前尚无定论。IRI发生的中心环节包括钙超载(Calcium overload)、氧化应激损伤(Oxidative stress injury)、启动细胞凋亡(Apoptosis)等。研究表明,肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system,RAS)参与了IRI病理生理过程。因此,通过干扰RAS系统,可能减轻IRI。血管紧张素-(1-7)[Angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]是RAS系统中近年才逐渐被认识的又一重要的活性多肽。它在内切酶的作用下由Ang-Ⅰ或Ang-Ⅱ裂解而成。Ang-(1-7)具有与Ang-Ⅱ相拮抗的生理作用,如抑制Ang-Ⅱ引起的血管收缩、平滑肌和心肌细胞的肥大等。另外,Ang-(1-7)可减轻Ang-Ⅱ介导的血管平滑肌细胞内钙超载;也可直接作用于血管内皮细胞,促进一氧化氮(NO)的产生,而扩张血管。因此,可以推测在缺血再灌注过程中,Ang-(1-7)也有可能与Ang-Ⅱ的作用相反,对心肌具有保护作用。在缺血再灌注之前或期间,如果给予外源性Ang-(1-7)或使内源性Ang-(1-7)的生成增多,有可能直接作用于心肌细胞,抑制细胞内钙超载和自由基产生,抑制细胞凋亡,使缺血再灌注损伤减轻。   有研究发现,热休克蛋白70(Heat shock protein70,HSP70)具有心肌保护作用,包括增强心肌收缩力、缩小心肌缺血坏死范围、抗心律失常作用等。HSP70对损伤心肌保护作用与其阻止再灌注损伤时氧自由基的释放和细胞内钙反常及抗炎作用有关。此外,HSP可以通过两条通路阻断细胞的凋亡:①阻断细胞色素介导的凋亡通路;②抑制细胞内应激酶((jun N-teriminal kinase,JNK)的激活。HSP70与细胞色素C和HSP21的复合物结合可阻断HSP29前体的活化,从而阻断信号通路,抑制应激诱导的激活,从而减少细胞的凋亡。基于以上研究设计并完成了以下实验。   目的和意义:   探讨Ang-(1-7)对IR诱导心肌细胞损伤和致心肌细胞凋亡作用的影响;以及Ang-(1-7)对IR诱导的心肌细胞内钙超载、氧化应激反应、心肌细胞HSP70表达的影响。通过上述研究有利于深入阐明Ang-(1-7)的心肌细胞保护作用及其机制,为防治心肌缺血再灌注引起心肌损伤提供新的治疗靶点,为研制新型的抗心肌缺血再灌注损伤药物开拓新的思路。   实验方法:   参照David等人介绍的方法在乳鼠原代心肌细胞上,建立模拟心肌缺血再灌注损伤模型。应用CCK-8试剂盒(日本Dojindo Lab)检测心肌细胞存活率;应用全自动生化仪测定培养基上清液中乳酸脱氢酶(LDH)水平;Hoechst33258(美国Sigma Aldrich公司)核染色观察凋亡细胞形态和数量的变化;Fluo-3AM荧光探针荧光显微镜照相术测定细胞内钙离子浓度;DCFH-DA染色荧光显微镜照相术检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;Western blot法检测心肌细胞HSP70蛋白表达。   实验结果:   1、在出生1-3天的SD乳鼠,分离和培养原代心肌细胞(功能合体细胞)。给原代心肌细胞不同时间缺血(分别为2h、4h、5h、6h、8h)和2h再灌注处理后,细胞存活率分别降低为95.2±1.3%、66.0±4.2%、52.0±1.9%、38.1±2.3%、27.3±0.7%,经相关性分析r=-0.98,提示缺血再灌注可以时间依赖性地损伤乳鼠心肌细胞。在缺血5h、再灌注2h的实验组,细胞的存活率约为50%左右,把这一实验参数定为缺血再灌注(IR)的固定损伤因素进行下面的实验。随着Ang-(1-7)干预浓度的增大,对心肌细胞的保护作用逐渐体现出来,说明Ang-(1-7)是浓度依赖性的。以10-6mol/L浓度的Ang-(1-7)作为以下检测预处理的确定浓度。   2、IR对心肌细胞有明显的损伤作用,使乳酸脱氢酶(LDH)释放增多(140.5±3.6%),与正常对照组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01)。10-6mol/LAng-(1-7)本身不影响LDH的基础释放,但10-6mol/L Ang-(1-7)预处理可明显地对抗IR对心肌细胞的损伤作用,使LDH释放降低至(123.2±1.9%),与IR组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。   3、Hoechst33258核染色法检测细胞凋亡的结果显示,IR具有明显的诱导心肌细胞凋亡作用,使心肌细胞凋亡率明显升高(37.1±2.6%)。10-6mol/LAng-(1-7)本身对心肌细胞的凋亡率无明显影响,但是,在IR前应用10-6mol/L Ang-(1-7)预处理30min能明显地抑制IR引起的心肌细胞凋亡,使心肌细胞的凋亡率降低至(18.5±1.9)%,与IR组比较,差异具有显著统计学意义(P<0.01),结果提示Ang-(1-7)具有保护心肌细胞对抗IR的致凋亡作用。   4、IR能促进心肌细胞内钙释放。10-6mol/LAng-(1-7)本身不影响钙释放,但10-6mol/L Ang-(1-7)预处理能明显地阻断IR引起的钙超载,与IR组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。   5、IR诱导心肌细胞产生明显的氧化应激反应,使活性氧(ROS)生成明显增多;10-6mol/LAng-(1-7)本身不影响ROS生成,但10-6mol/LAng-(1-7)预处理显著地抑制IR诱导心肌细胞生成ROS增多,提示Ang-(1-7)具有抗心肌细胞氧化应激反应作用。   6.、IR能增加心肌细胞热休克蛋白(HSP70)表达。提示HSP70是心肌细胞对抗IR损伤的内源性防御机制之一。10-6mol/L Ang-(1-7)本身对心肌细胞HSP70表达无明显影响,但10-6mol/L Ang-(1-7)预处理在保护心肌细胞对抗IR诱导的损伤同时,没有进一步增加IR诱导的HSP70表达上调,而且使HSP70表达明显减少,与IR组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),提示这可能与Ang-(1-7)明显减轻IR对心肌细胞损伤后,HSP70对IR反应减弱有关。   结论:   1、模拟缺血再灌注对心肌细胞具有明显的损伤作用,使细胞存活率降低,使细胞凋亡率、LDH释放、胞内钙释放及ROS生成均明显增多,并使HSP70表达增多。   2、Ang-(1-7)能保护心肌细胞对抗IR诱导的损伤,使细胞存活率升高,使细胞凋亡率、LDH释放、胞内钙释放及ROS生成均明显减少。Ang-(1-7)本身对心肌细胞HSP70表达无明显影响,Ang-(1-7)可能通过抗缺血再灌注使细胞损伤程度减轻从而HSP70表达减少。
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